Cryopreservation of Araucaria angustifolia (BERT.) O. Kuntze: physiological and biochemical aspects.

Técnicas de cultivo in vitro, associadas à criopreservação, são ferramentas importantes para conservação ex situ de espécies recalcitrantes. O objetivo deste trabalho foi o estudo da criopreservação no sistema A. angustifolia. Um protocolo de criopreservação para culturas celulares da espécie foi desenvolvido e os níveis de PAs, ABA e ROS, ao longo do protocolo, foram avaliados. Embriões zigóticos foram utilizados como modelo para o estudo de diferentes aspectos biofísicos do processo de criopreservação como a permeabilidade dos crioprotetores, a capacidade de resposta osmótica e congelamento, presença de água nos tecidos e a análise histológica da organização e aspectos das estruturas celulares, comparados ao controle, não resfriado. Os resultados deste trabalho permitiram uma melhor compreensão dos diferentes aspectos fisiológicos, bioquímicos e biofísicos durante a criopreservação, em espécies recalcitrantes, além da perspectiva de estabelecimento de bancos de germoplasma ex situ de culturas celulares de A. angustifolia.The aim of this work was the study of cryopreservation A. angustifolia plant systems. A protocol for cryopreservation of A. angustifolia cell cultures was developed based on optimum DMSO concentration. It was observed that cells exposed to cryoprotectants showed lower levels of PAs, ABA and ROS compared to cells that were not exposed to them. Two low molecular weight bands could be observed more intensely stained only in the cells that were exposed to the cryoprotectant. The zygotic embryos were used as a model to study different aspects of the biophysical process of cryopreservation such as the permeability of cryoprotectants, osmotic and response characteristics of water freezing in tissue. The results of this work led to a better understanding of different physiological, biochemical and biophysical factors during cryopreservation in recalcitrant species and open perspective to the establishment of the ex situ conservation of A. angustifolia

Quantification of amino acids, polyamines, IAA, ABA and protein markers on the germination of Ocotea odorifera Vell. (Lauraceae) seeds

Ocotea odorifera é uma espécie nativa da Mata Atlântica, com características recalcitrantes, que se encontra em risco de extinção devido a sua exploração econômica. Técnicas baseadas na biotecnologia podem ser utilizadas para o processo de conservação e reintrodução no seu ambiente natural de espécies ameaçadas de extinção. Dentre as técnicas biotecnológicas, a embriogênese somática (ES) vem sendo utilizada com bastante sucesso em programas de melhoramento genético e conservação de germoplasma de espécies arbóreas. Contudo, para o estabelecimento de protocolos eficientes de ES são necessários estudos básicos de fisiologia e bioquímica do desenvolvimento da semente e da germinação, para que as condições in vivo possam ser recriadas de forma eficiente in vitro. O objetivo deste trabalho foi avaliar as variações no conteúdo endógeno de aminoácidos, PAs, AIA, ABA e estabelecer marcadores protéicos durante a germinação de sementes de O. odorifera. As sementes foram germinadas em substrato de vermiculita em fotoperíodo de 16h a 27°C. A seguir, coletadas após 0, 15, 30 e 45 dias de semeadura. Foi observado que: a) o conteúdo de aminoácidos aumentou durante o processo germinativo. A asparagina foi observada em maior quantidade e predominou durante todo o período analisado. A metionina e a ornitina, precursores das PAs, e o triptofano, precursor do AIA, aumentaram ao longo do processo germinativo; b) o conteúdo total de PAs decresceu nos últimos 15 dias de avaliação. Neste período, as poliaminas conjugadas apresentaram aumento indicando possível relação entre conjugação e disponibilidade de PAs nas células; c) a relação Put/(Spm+Spd) diminui ao final do período analisado enquanto no mesmo período a Spm foi a PA livre mais abundante indicando relação entre Spm e alongamento celular; d) O AIA apresentou aumento ao logo do processo germinativo, ao mesmo tempo em que a queda no conteúdo de ABA pode ser observada; e) o conteúdo de proteínas decresceu ao longo do processo germinativo. Os perfis protéicos diferiram pouco entre os estádios analisados. Entretanto, foi observada variação significativa na abundância (% de volume) em 39 spots, que foram definidos como marcadores do processo germinativo. Dentre esses spots incluem-se 26 que reduziram e 2 spots que aumentaram suas abundâncias ao longo do processo germinativo, 10 que apresentaram tanto aumento quanto diminuição durante o período observado e apenas 1 exclusivo da semente madura. Estes resultados abrem perspectivas para a avaliação de parâmetros fundamentais para a otimização de protocolos de ES e permitiram uma maior compreensão das variações endógenas dos diferentes compostos citados no processo germinativo das sementes de O. odorifera.Ocotea odorifera is a native tree from the Atlantic Forest with recalcitrant features that is in risk of extinction because its economical exploration. Techniques based on biotecnology can be used for the conservation and reintroduction process of species in risk of extinction in their natural environment. Between these biotecnologycal techniques, the somatic embryogenesis (SE) have been used sucessfully in programs of genetic breeding and tree germoplasm conservation. However, basic studies of physiology and biochymical of the seed development and germination are necessary for the establishment of efficient protocols of SE. Thus, these condictions in vivo can be recriated in vitro. The aim of this work was to evaluate the variations in the endogenous content of amino acids, polyamines, IAA, ABA and protein markers throughout the seed germination of O. odorifera seeds. The seeds were germinated on vermiculite substrate at 27°C and 16h of photoperiod and collected after 0, 15, 30 e 45 days of sowing. It was observed that: a) the amino acids content increased troughout the germination process. Asparagine was the highest content sighted and prevailed during the period studied. Methionine and ornithine, polyamines precursors, and tryptophan, IAA precursor, increased troughout germination process; b) the total PAs content decreased in the last 15 days of evaluation. At the same period, conjugated PAs showed an increase, indicating a relation between conjugation and avalability of polyamines inside the cells; c) the Put/(Spm+Spd) relation decreased while the Spm was the most abundant free PA observed at the end of the period analyzed indicating a relation between Spm and celular elongation; d) IAA increased during all the process while a decrease of ABA was sigthed; e) protein content decreased troughout the period observed. The proteic profile didnt change a lot between the stages. Os perfis protéicos diferiram pouco entre os estádios analisados. Entretanto, foi observada variação significativa na abundância (% de volume) em 39 spots, que foram definidos como marcadores do processo germinativo. Among them, could be include 26 that decreased and 2 that decreased its abundances troughout the germinative process, 10 that both increased and decreased throughout the period analyzed and just 1 exclusive from mature seed. These results open perspectives to avaliation of fundamentals parameters to optmization of ES protocols and allow a better comprehension about the edogenous variation of the differents compounds citeds in the process of O. odorifera seeds germination

Polyamines, IAA and ABA during germination in two recalcitrant seeds: Araucaria angustifolia (Gymnosperm) and Ocotea odorifera (Angiosperm)

Background and Aims Plant growth regulators play an important role in seed germination. However, much of the current knowledge about their function during seed germination was obtained using orthodox seeds as model systems, and there is a paucity of information about the role of plant growth regulators during germination of recalcitrant seeds. In the present work, two endangered woody species with recalcitrant seeds, Araucaria angustifolia (Gymnosperm) and Ocotea odorifera (Angiosperm), native to the Atlantic Rain Forest, Brazil, were used to study the mobilization of polyamines (PAs), indole-acetic acid (IAA) and abscisic acid (ABA) during seed germination. Methods Data were sampled from embryos of O. odorifera and embryos and megagametophytes of A. angustifolia throughout the germination process. Biochemical analyses were carried out in HPLC. Key Results During seed germination, an increase in the (Spd + Spm) : Put ratio was recorded in embryos in both species. An increase in IAA and PA levels was also observed during seed germination in both embryos, while ABA levels showed a decrease in O. odorifera and an increase in A. angustifolia embryos throughout the period studied. Conclusions The (Spd + Spm) : Put ratio could be used as a marker for germination completion. The increase in IAA levels, prior to germination, could be associated with variations in PA content. The ABA mobilization observed in the embryos could represent a greater resistance to this hormone in recalcitrant seeds, in comparison to orthodox seeds, opening a new perspective for studies on the effects of this regulator in recalcitrant seeds. The gymnosperm seed, though without a connective tissue between megagametophyte and embryo, seems to be able to maintain communication between the tissues, based on the likely transport of plant growth regulators.FAPESPFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)CNPqPetrobrasPetróleo Brasileiro S.A. (PETROBRAS