Análise quantitativa da expressão de genes candidatos em genótipos de Coffea arabica submetidos ao défict hídrico : [Resumo]

Os programas de melhoramento genético do cafeeiro consistiram em identificar e utilizar a variabilidade natural existente no gênero Coffea criando novos híbridos adaptados às exigências de maior produtividade e qualidade da bebida. A potencial elevação das temperaturas, em função do aquecimento global, torna-se um desafio real no cumprimento de tais exigências demandando o desenvolvimento de novas variedades tolerantes à seca. O aperfeiçoamento das ferramentas moleculares geradas pelos recentes avanços na genômica do café possibilita o estudo dos mecanismos gênicos e a identificação dos genes responsíveis ao défict hídrico. O objetivo desse estudo foi analisar, em folhas de plantas de Coffea arabica, a expressão de genes candidatos (GC) identificados por análises in silico dos dados do projeto Genoma café, hibridizações de macroarranjos e observações do perfil protéico em géis de eletroforese 2D de folhas de plantas submetidas ao estresse hídrico. Os genes candidatos foram identificados em estudos com clones tolerantes e sensíveis de Coffea canephora variedade Conilon realizado em condições controladas (casa de vegetação). Neste experimento foram utilizadas folhas de plantas de Coffea arabica variedades Iapar 59 (tolerante) e Rubi (sensível), submetidas a diferentes regimes hídricos, em condições de campo. O potencial hídrico das plantas foi acompanhado durante as coletas e mensurado com uma bomba de Sholander. O material biológico utilizado para análise foi referente a três pontos de coletas que representam: potencial hídrico basal, menor potencial hídrico de antemanhã e o potencial de recuperação após o retorno da irrigação. A expressão relativa foi analisada por PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Os resultados indicam que foi possível identificar genes diferencialmente expressos, envolvidos na resposta ao déficit hídrico, nos cultivares de Coffea arabica testados, em condições de campo. (Résumé d'auteur

Construção de macroarranjos de cDNA de café, para a identificação de genes de interesse agronômico

To make the Coffee cDNA-Macroarrays, a non-reduntant group of clones (Unigene) was initially generated by bioinformatics analysis of the Brazilian Coffee Genome Database. The re-arraying routine was performed with the Q-Bot system (Genetix) and resulted in a non-redundant group of 33,000 clones organized in 86 plates (384). Plasmid DNA from all 33 thousand clones was extracted and representative samples were analyzed by gel electrophoresis. To check the accuracy of the re-arraying routine, 4 samples per plate were sequenced and compared by BlastN analysis against the Coffee Database. The results of this analysis indicated 8% mistakes during the re-arraying routine. Plates containing mistakes were re-arrayed and novel samples sequenced. The next step for the Macroarray construction is the printing of the membranes and the objective of this work was to establish the best protocol for this routine. The type of DNA (plasmid vs. PCR product) and the concentration were the variables evaluated. The results obtained with the hybridization experiments indicated that in general the printing routine with the Q-Bot system was very uniform and accurate among the replicates. In addition, the data obtained indicated that the radioactive signals obtained with the PCR product-spots were stronger than the ones obtained with plasmid DNA due to the different molar ratio and probably also, due to the better denaturing step of a linear DNA fragment

Drought tolerance in Coffee: Identification of candidate genes and study of its natural variation : [Abstract W154]

Drought stress significantly affects coffee yield, productivity and quality. Thus, the goal of this study was to investigate the molecular mechanisms underlying the response to drought stress in coffee plants by different approaches. Candidate gene identification was performed by comparing gene expression and protein profile of different genetic materials (tolerant vs. susceptible) as well as, under different conditions of water supply (irrigated vs. non-irrigated). In this work, the genetic materials studied were Conillon clones of Coffea canephora and two cultivars of C. arabica. The applied water stress (PD=-3,0 MPa) to the conillon plants was achieved under green-house conditions and, in the case of arabica, adult plants cultivated under field conditions were used. Under field conditions, leaves were collected during day and night, and the most pronounced observed water-stress was of PD =-1,7 MPa. After selection of candidate genes by different strategies, the expression was confirmed by qPCR analysis. The natural variation of some selected candidate genes was also performed using a set of different genotypes. The data obtained indicated that several genes displayed decreased expression upon water stress and usually these were encoding-genes of proteins involved in photosynthesis. On the other hand, the applied water stress on coffee plants also induced a set of genes such as RD29, DREBA and NAC, which have already been described in literature as genes involved in plant responses to drought. In addition, this study also revealed the importance of other factors controlling the expression of these genes, such as the circadian clock and the age. (Texte intégral

Identificação e caracterização de genes candidatos para a tolerancia a sega em clones de café conilon (Coffea canephora) : [Preprint]

The coffee business worldwide shows that coffee is economically important for many countries. For Brazil, the largest producer and exporter of coffee, this commodity is usually a major source of income to small farmers. Drought periods have become increasingly intense over the recent years, affecting the production of these farmers as it reduces productivity and can even cause irreversible crop damage. Nowadays, the elucidation of the genetic factors involved in drought tolerance is amongst the priorities of several research groups. Responses to drought stress certainly involve changes in gene expression and the goal of this work, was the characterization of the gene expression profile on leaves of a sensitive clone of C. canephora (clone 22) and a tolerant clone (clone 14), grown under control and water stress conditions. The technique used in this study was the hybridization of DNA macroarrays, which was efficient to identify genes differentially expressed between the treatments used (irrigated and non irrigated) as well as differences between the genotypes studied (clone tolerant x sensitive). These differentially expressed genes are potential candidates for drought tolerance in coffee and may be subject to further experimental studies. The previously selected genes on the macroarrays experiments were further characterized by real-time quantitative PCR assays (qPCR). In general, most of the results obtained by the qPCR analysis corroborated with the differential expression observed with the macroarrays experiments.(Résumé d'auteur

Analise de expressao polimorfismo nucleicos de genes candidatos para a tolerancia a seca em cafeeiro

O presente trabalho teve como objetivos (i) analisar a expressão de genes candidatos (GC), que foram previamente identificados em plantas de Coffea canephora,e agora analisar a expressão em plantas de Coffea arabica cultivadas no campo e submetidas e não submetidas ao estresse hídrico e (ii) avaliar a diversidade genética de alguns GCs por meio da busca dos polimorfismos nucléicos. Os experimentos de expressão gênica foram realizados com os cultivares IAPAR59 (tolerantes à seca) e Rubi (sensível à seca) de C. arabica cultivados com e sem irrigação durante a estação seca. As folhas foram amostradas no ano de 2008 foram utilizadas para analisar a expressão de GCs por PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Em paralelo, seqüências gênicas correspondentes aos GC foram clonadas e seqüenciadas a partir do DNA genômico de diferentes espécies, clones e cultivares de cafeeiro. Os polimorfismos foram identificados e permitiram de definir os haplótipos encontrados nos genótipos estudados. (Résumé d'auteur

Caracterizaçao da regiao promotora do gene DREB2A de genotipos de Coffea canephora constrastantes para a tolerancia a seca

Apesar de alguns estudos em fisiologia vegetal resultarem em uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na tolerância à seca em cafeeiro, ainda é escasso o conhecimento acerca das alterações metabólicas e moleculares envolvidos na resposta do cafeeiro às condições de estresse hídrico. Neste sentido, resultados prévios obtidos, analisando-se a expressão relativa do gene DREB2A dos clones 14 (tolerante a seca) e 22 (sensível a seca) de Coffea canephora var. Conilon, demonstraram expressão diferencial desse gene em folhas de plantas submetidas ou não ao estresse hídrico. Polimorfismos na região promotora do gene DREB2A foram identificados e podem indicar a participação de diferentes haplótipos no controle genético da tolerância a seca. O objetivo deste trabalho consiste na engenharia de cassetes gênicos utilizando o vetor binário pBI121 combinado com diferentes segmentos da região promotora do gene DREB2A, isolados dos clones 14 e 22 de C. canephora com o intuito de permitir uma melhor caracterização in vivo, da participação dos elementos cis e da influência dos polimorfismos observados na funcionalidade deste promotor em relação às respostas do cafeeiro ao estresse hídrico. (Résumé d'auteur

Isolamento e caracterizaçao de promotor fruto-espicifico do gene CALTP1 de Coffea arabica

A disponibilidade de promotores endógenos, não patenteados, que regulem a expressão do transgenes de forma limitada espacial e temporalmente é uma valiosa ferramenta para programas de melhoramento. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar o promotor fruto específico do gene CALTP1 (que codifica uma proteína de transferência de lipídeos - LTP) de Coffea arabica. Por meio de análises in silico baseadas nas seqüências do banco de dados do genoma café, foram encontrados 40 Unigenes preferencialmente expressos em fruto que poderiam ser utilizados como sonda na prospecção de seus respectivos promotores. Usando como critérios o nível de expressão e o ineditismo, o gene CALTP1 foi escolhido para a validação experimental por meio das técnicas de Northern blot e RTqPCR. Os resultados demonstram que esse gene tem expressão preferencial no endosperma dos frutos aos 120 e 180 dias após o florescimento (DAF). O isolamento do promotor desse gene foi feito por meio da estratégia 5' RACE. Um fragmento de 1.2 kb foi isolado do DNA genômico de C. arabica var. Catuaí amarelo e três fragmentos menores (1.0, 0.78 e 0.4 kb) oriundos de supressões 5' do fragmento genômico foram produzidos. Esses fragmentos foram clonados em vetores binários e transformados na planta modelo Nicotiana tabacum para análises de expressão envolvendo o gene repórter uidA codificando para a ?-glucuronidase (GUS). Os resultados das análises histoquímicas de atividade GUS mostram que os fragmentos de 1.2, 1.0 e 0.78 kb direcionam a expressão para todos os órgãos testados da planta com diferenças no nível de atividade e, todos os três fragmentos promovem expressão baixa ou nula em raízes. Por outro lado, o fragmento menor de 0.4 kb levou a expressão do gene uidA somente nas sementes, tecidos florais e frutos. (Résumé d'auteur

Identificação de genes com expressão diferencial em folhas de cafeeiro Coffea canephora e Coffea arabica submetidas a differentes condições de estresse hidrico : [Preprint]

Aiming at the establishment of a breeding program based on marker-assisted selection for drought tolerance on coffee, the present work had as a goal, the identification of candidate genes for this trait by using an integrated approach (gene expression and proteomics). The data was obtained by comparing gene expression and protein profile of different genetic materials (Tolerant vs. Susceptible) as well as, under different conditions of water supply (Irrigated vs. Non-irrigated). In this work, the genetic materials studied were the conillon clones 22 and 14 (Coffea canephora) and the cultivars Rubi and Iapar 59 (Coffea arabica). The applied water stress (?PD=-3,0 MPa) to the conillon plants was achieved under green-house conditions and, in the case of Arabica, adult plants cultivated under field conditions were studied. In the later case, leaves were collected during day and night, and the most pronounced observed water-stress was of ?PD=-1,7 MPa. After selection of candidate genes by different strategies, the expression was confirmed by qPCR analysis. The data obtained indicated that several genes displayed decreased expression upon water stress and usually these were encoding-genes of proteins involved in photosynthesis. On the other hand, the applied water stress on coffee plants also induced a set of genes such as RD29, DREBA and NAC, which have already been described in literature as genes involved in plant responses to drought. In the case of a Dehydrin encoding-gene, the data obtained in this work confirmed previously observed differential expression on C. canephora, on C. arabica, also. However, this study revealed the importance of other factors controlling the expression of these genes, such as the circadian clock, the age as well as the profile of the plants and, these observations make the interpretation of differential expression data obtained from field trials even more complex. (Résumé d'auteur

Efeitos do estresse hidrico na composiçao bioquimica de graos de Coffea arabica cv. Rubi

Plantas adultas de C. arabica cv. Rubi cultivadas na estação experimental da Embrapa Cerrados foram submetidas a quatro regimes hídricos (RH1 até RH4): RH1 correspondente a irrigação contínua e RH2 até RH4 correspondem respectivamente, a 30, 60 e 90 dias de estresse hídrico antes do retorno da irrigação. Como controle, as plantas do regime RH0 permaneceram sem irrigação. Os grãos produzidos a partir dessas plantas foram analisados utilizando a técnica de espectroscopia de infravermelho próximo (NIRS) para avaliar os efeitos do estresse hídrico sobre os níveis de alguns compostos bioquímicos tais como a cafeína, os lipídios totais, a sacarose e os ácidos clorogênicos, durante três anos consecutivos (2007 até 2009). Os resultados mostram um efeito significativo do estresse hídrico sobre cafeína e ácidos clorogênicos em 2007 e 2008, com redução dos teores destes compostos bioquímicos com o estresse hídrico. Do outro lado, um efeito significativo do estresse hídrico sobre a sacarose (em 2007 e 2009) e de lipídeos totais (em 2007-2009), com conteúdo crescente destes compostos bioquímicos com o estresse hídrico, foi também observado. (Résumé d'auteur

Desenvolvimento de uma metodologia para a identificaçao de metabolitos durante o desenvolvimento do frutos de café

O gênero Coffea pertence à família Rubiaceae e compreende aproximadamente 100 espécies. A maioria do café comercialmente disponível consiste de grãos produzidos pelas espécies C. arabica e C. canephora. O sabor e o aroma da bebida de café são altamente complexos, resultantes da presença combinada de vários constituintes químicos voláteis e não voláteis, que compõem os aromas e sabores. A bebida possui também muitos compostos fenólicos que são metabólitos secundários das plantas e estão envolvidos na adaptação aos estresses. Eles conferem ao café potentes efeitos biológicos, incluindo atividades antioxidantes, antimutagenicas, anticarcinogenicas, antibioticas, antihipertensivas, antihipercolesterolemicas e antiinflamatorias. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia eficaz para identificar um desses compostos fenólicos, a arbutina, no pericarpo e o endosperma dos grãos de café de Coffea arabica var. IAPAR59 (I59). Assim, diferentes estágios de maturação desses dois tecidos foram testados usando a técnica de cromatografia líquida de alta eficência (UFLC). Para cada amostra, foi feita uma corrida com o extrato bruto e outra com o extrato contendo o padrão comercial (arbutina). Os resultados mostram que a arbutina não foi detectada nas amostras analisadas. Entretanto, esse composto fenólico pode estar associado ou complexado com outras moléculas, o que alteraria o perfil de eluição desta molécula, quando comparado ao padrão. Estudos posteriores em outros estágios fenólogicos do fruto assim como outros tecidos da planta ainda deverão serfeitos para se avaliar esta hipótese. (Résumé d'auteur