Estudio de proteínas solubles que unen lípidos (SLBP) intracelulares expresadas en sistemas que metabolizan grandes cantidades de lípidos : Caracterización biofisicoquímica, estructural y funcional de IFABP y LFABP de enterocito de mamífero e YLSCP2 de Yarrowia lipolytica

Los lípidos son compuestos que cumplen una gran variedad de funciones en la biología celular, desde componentes estructurales o nutrientes de reserva hasta señales hormonales o incluso feromonas pasando por moduladores de la transcripción y pigmentos fotosintéticos. Sin embargo, por definición, estos compuestos poseen una muy baja solubilidad en el medio acuoso celular. Por tal motivo, se cree que han evolucionado diferentes familias de proteínas solubles, capaces de unir lípidos en forma reversible en el citosol, las SLBP (Soluble Lipid Binding Proteins) intracelulares. Dentro de este conjunto de proteínas, las familias mejor caracterizadas corresponden a las proteínas que unen ácidos grasos (FABP) y las proteínas transportadoras de esteroles (SCP-2), ambas con capacidad de unir ácidos grasos de cadena larga. Cada familia de proteínas SLBP posee varias isoformas que presentan un patrón de expresión y especificidad de unión de ligando hidrofóbicos únicos. Se cree que estas diferencias residen en una baja identidad de secuencia (tan sólo un 20%), a pesar de la cual adoptan estructuras tridimensionales prácticamente superponibles. A fin de contribuir en la identificación determinantes estructurales críticos y las funciones específicas de las SLBP se estudiaron tres proteínas modelo que participan de tipos celulares que muestran una capacidad de metabolismo lipídico extraordinario, como son las células de enterocito intestinal de mamífero y las levaduras Yarrowia lipolytica. En el primer caso se coexpresan dos FABP en niveles prácticamente equivalentes. Por un lado se analizó in vitro el rol de residuos de Lys específicos de la IFABP en la transferencia de ácidos grasos, siendo estos importantes para el sensado de las características de las membranas aceptoras. Ensayos de interacción con membrana revelaron que tanto IFABP como LFABP muestran moduladores distintos de su interacción con bicapas fosfolipídicas, y que en particular las regiones α-helicoidal serían críticas para este fenómeno. Asimismo, se demostró la transferencia in vitro de ligandos entre ambas FABP intestinales. Finalmente, se comprobó que la expresión de LFABP en células Caco-2 en cultivo afecta la asimilación de ácidos grasos, así como su distribución a tiempos cortos. El análisis comparativo de estas proteínas parece indicar que cumplirían funciones diferentes dentro del entorno celular. En el caso de Y. lipolytica, sólo una SLBP es expresada con capacidad de unir ácidos grasos libres, representante de la familia de las SCP-2, YLSCP2. El análisis in vitro de sus capacidades de unión y de transferencia de ligandos hacia membranas aceptoras en distintas condiciones demostró que la YLSCP2 podría cumplir un rol de transporte de ligando hidrofóbicos hacia estructuras intracelulares específicas. En conclusión, estas proteínas no sólo son capaces de actuar como buffer citosólico de lípidos aumentando así su disponibilidad para los distintos procesos celulares, sino que también son capaces de modular o regular su metabolismo. Más estudios son necesarios para poder comprender mejor las funciones específicas de estas SLBP, pero los secretos que esconden sus estructuras podrían tener importantes aplicaciones en áreas diversas como medicina, nutrición, industria biotecnológica y el tratamiento de efluentes industriales.Facultad de Ciencias Exacta

Protein-membrane interaction and fatty acid transfer from intestinal fatty acid-binding protein to membranes: Support for a multistep process

Fatty acid transfer from intestinal fatty acid-binding protein (IFABP) to phospholipid membranes occurs during protein-membrane collisions. Electrostatic interactions involving the α-helical "portal" region of the protein have been shown to be of great importance. In the present study, the role of specific lysine residues in the α-helical region of IFABP was directly examined. A series of point mutants in rat IFABP was engineered in which the lysine positive charges in this domain were eliminated or reversed. Using a fluorescence resonance energy transfer assay, we analyzed the rates and mechanism of fatty acid transfer from wild type and mutant proteins to acceptor membranes. Most of the α-helical domain mutants showed slower absolute fatty acid transfer rates to zwitterionic membranes, with substitution of one of the lysines of the α2 helix, Lys27, resulting in a particularly dramatic decrease in the fatty acid transfer rate. Sensitivity to negatively charged phospholipid membranes was also reduced, with charge reversal mutants in the α2 helix the most affected. The results support the hypothesis that the portal region undergoes a conformational change during protein-membrane interaction, which leads to release of the bound fatty acid to the membrane and that the α2 segment is of particular importance in the establishment of charge-charge interactions between IFABP and membranes. Cross-linking experiments with a phospholipid-photoactivable reagent underscored the importance of charge-charge interactions, showing that the physical interaction between wild-type intestinal fatty acid-binding protein and phospholipid membranes is enhanced by electrostatic interactions. Protein-membrane interactions were also found to be enhanced by the presence of ligand, suggesting different collisional complex structures for holo- and apo-IFABP.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plat

Protein-membrane interaction and fatty acid transfer from intestinal fatty acid-binding protein to membranes: Support for a multistep process

Fatty acid transfer from intestinal fatty acid-binding protein (IFABP) to phospholipid membranes occurs during protein-membrane collisions. Electrostatic interactions involving the α-helical "portal" region of the protein have been shown to be of great importance. In the present study, the role of specific lysine residues in the α-helical region of IFABP was directly examined. A series of point mutants in rat IFABP was engineered in which the lysine positive charges in this domain were eliminated or reversed. Using a fluorescence resonance energy transfer assay, we analyzed the rates and mechanism of fatty acid transfer from wild type and mutant proteins to acceptor membranes. Most of the α-helical domain mutants showed slower absolute fatty acid transfer rates to zwitterionic membranes, with substitution of one of the lysines of the α2 helix, Lys27, resulting in a particularly dramatic decrease in the fatty acid transfer rate. Sensitivity to negatively charged phospholipid membranes was also reduced, with charge reversal mutants in the α2 helix the most affected. The results support the hypothesis that the portal region undergoes a conformational change during protein-membrane interaction, which leads to release of the bound fatty acid to the membrane and that the α2 segment is of particular importance in the establishment of charge-charge interactions between IFABP and membranes. Cross-linking experiments with a phospholipid-photoactivable reagent underscored the importance of charge-charge interactions, showing that the physical interaction between wild-type intestinal fatty acid-binding protein and phospholipid membranes is enhanced by electrostatic interactions. Protein-membrane interactions were also found to be enhanced by the presence of ligand, suggesting different collisional complex structures for holo- and apo-IFABP.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plat

Análisis estructural y funcional de macromoléculas

El objetivo de este libro es incentivar a alumnos y docentes del área de bioquímica y afines a acercarse a un grupo de metodologías modernas que se aplican a la comprensión de los principios moleculares responsables de los procesos biológicos, en particular aquellos referidos a las proteínas. Desde los años ´90, el advenimiento de la genómica y proteómica ha permitido identificar un gran número de proteínas para las cuáles sólo se cuenta con su estructura primaria. Para profundizar la caracterización estructural y funcional de dichas proteínas, ha sido necesario contar con diversas herramientas bioquímicas y biofísicas. Hoy en día se han desdibujado los límites entre las distintas disciplinas de las ciencias naturales, siendo necesaria una visión integral, provista por la biofisicoquímica, que abarque las técnicas complementarias disponibles actualmente. (Párrafo extraído del texto a modo de resumen)Facultad de Ciencias Exacta

Fatty acid transfer from Yarrowia lipolytica sterol carrier protein 2 to phospholipid membranes

Sterol carrier protein 2 (SCP2) is an intracellular protein domain found in all forms of life. It was originally identified as a sterol transfer protein, but was recently shown to also bind phospholipids, fatty acids, and fatty-acyl-CoA with high affinity. Based on studies carried out in higher eukaryotes, it is believed that SCP2 targets its ligands to compartmentalized intracellular pools and participates in lipid traffic, signaling, and metabolism. However, the biological functions of SCP2 are incompletely characterized and may be different in microorganisms. Herein, we demonstrate the preferential localization of SCP2 of Yarrowia lipolytica (YLSCP2) in peroxisome-enriched fractions and examine the rate and mechanism of transfer of anthroyloxy fatty acid from YLSCP2 to a variety of phospholipid membranes using a fluorescence resonance energy transfer assay. The results show that fatty acids are transferred by a collision-mediated mechanism, and that negative charges on the membrane surface are important for establishing a "collisional complex". Phospholipids, which are major constituents of peroxisome and mitochondria, induce special effects on the rates of transfer. In conclusion, YLSCP2 may function as a fatty acid transporter with some degree of specificity, and probably diverts fatty acids to the peroxisomal metabolism.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La PlataInstituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicada

Unraveling intestinal fatty acid binding proteins functions: analysis of FABP-membrane and FABP-protein interactions

We expect to identify the interaction partners of intestinal FABPs in order to describe the molecular crosstalk relevant for its biological functions.Facultad de Ciencias Médica

Autoagregación de apolipoproteína A-I humana : Estudios con mutantes de cisteína marcadas con pirenil-maleimida

La apolipoproteína A-I (apoAI) es la proteína mayoritaria de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) a las que se les atribuye un rol antiaterogénico, en especial por su participación en el transporte del exceso de colesterol desde tejidos periféricos hacia el hígado para su catabolismo y eliminación. ApoAI está constituida por hélices anfipáticas que en agua forman un ramillete de estructura terciaria poco definida o glóbulo fundido; y que en función de la concentración se autoagrega para formar dímeros y oligómeros de diferente tamaño. Objetivos: obtener información sobre la autoagregación en solución e interacción con membrana de ApoA-I ya que es importante para comprender los mecanismos de generación de HDL, así como también la amiloideogénesis.Facultad de Ciencias Médica

Autoagregación de apolipoproteína A-I humana : Estudios con mutantes de cisteína marcadas con pirenil-maleimida

La apolipoproteína A-I (apoAI) es la proteína mayoritaria de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) a las que se les atribuye un rol antiaterogénico, en especial por su participación en el transporte del exceso de colesterol desde tejidos periféricos hacia el hígado para su catabolismo y eliminación. ApoAI está constituida por hélices anfipáticas que en agua forman un ramillete de estructura terciaria poco definida o glóbulo fundido; y que en función de la concentración se autoagrega para formar dímeros y oligómeros de diferente tamaño. Objetivos: obtener información sobre la autoagregación en solución e interacción con membrana de ApoA-I ya que es importante para comprender los mecanismos de generación de HDL, así como también la amiloideogénesis.Facultad de Ciencias Médica

Autoagregación de apolipoproteína A-I humana : Estudios con mutantes de cisteína marcadas con pirenil-maleimida

La apolipoproteína A-I (apoAI) es la proteína mayoritaria de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) a las que se les atribuye un rol antiaterogénico, en especial por su participación en el transporte del exceso de colesterol desde tejidos periféricos hacia el hígado para su catabolismo y eliminación. ApoAI está constituida por a-hélices anfipáticas que en agua forman un ramillete de estructura terciaria poco definida o glóbulo fundido; y que en función de la concentración se autoagrega para formar dímeros y oligómeros de diferente tamaño.Facultad de Ciencias Médica

Autoagregación de apolipoproteína A-I humana : Estudios con mutantes de cisteína marcadas con pirenil-maleimida

La apolipoproteína A-I (apoAI) es la proteína mayoritaria de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) a las que se les atribuye un rol antiaterogénico, en especial por su participación en el transporte del exceso de colesterol desde tejidos periféricos hacia el hígado para su catabolismo y eliminación. ApoAI está constituida por a-hélices anfipáticas que en agua forman un ramillete de estructura terciaria poco definida o glóbulo fundido; y que en función de la concentración se autoagrega para formar dímeros y oligómeros de diferente tamaño.Facultad de Ciencias Médica