Estandarización de dos PCR multiplex como base de un test de genotipado para pejerrey : Odontesthes bonariensis

El pejerrey bonaerense es una especie de gran importancia económica en Argentina. La piscicultura de pejerrey data de varias décadas en las que se ha poblado o repoblado ambientes con larvas. A pesar de la importancia de esta especie, la información sobre la diversidad genética de sus poblaciones, que sirva para la mejora de su producción o para la mitigación del impacto de las resiembras, es escasa. En este trabajo se propone el desarrollo de un test de genotipado basado en dos reacciones de PCR multiplex utilizando marcadores microsatélites. Se seleccionaron 13 marcadores descriptos en la bibliografía que fueron estandarizados. Luego, los marcadores se evaluaron en una población silvestre (n=20). Se extrajo el ADN a partir de tejido de cada individuo y se amplifico por PCR los 13 marcadores microsatélites. Los productos de amplificación fueron resueltos en geles de poliacrilamida teñidos con plata. Para cada individuo se obtuvo un genotipo. Para cada locus, se determinó el número de alelos, heterocigocidad observada y esperada, frecuencia de alelos nulos, contenidos de información polimórfica (PIC), y probabilidad de exclusión. Teniendo en cuenta estos parámetros, se seleccionaron 7 loci que fueron combinados en dos PCR multiplex M1 y M2 de acuerdo a los tamaños de los fragmentos que produce su amplificación. Los cebadores se marcaron fluorescentemente, y se estandarizaron las condiciones para M1 y M2. Las amplificaciones se evaluaron por electroforesis capilar. Dichas multiplex constituyen la base del Test de genotipado y grado de parentesco para pejerrey. Esta herramienta permitirá evaluar la diversidad genética y el grado de parentesco existente entre los reproductores de los centros de cultivo evitando la depresión consanguíneaFil: Sapino, Román. Facultad de Ciencias y Bioquímicas - Universidad Nacional de RosarioFil: Arranz, Silvia E. Facultad de Ciencias y Bioquímicas - Universidad Nacional de RosarioFil: Diaz, Juan. Facultad de Ciencias y Bioquímicas - Universidad Nacional de RosarioFil: Faggiani, Mariano. Centro Científico, Tecnológico y Educativo "Acuario del Río Paraná"Fil: Villanova, Gabriela V. Centro Científico, Tecnológico y Educativo "Acuario del Río Paraná

Estudio de la miogénesis en peces teleósteos

El crecimiento del músculo esquelético está condicionado por 1) el aumento en tamaño de las fibras musculares (hipertrofia) y 2) por el aumento en el número de fibras musculares (hiperplasia). Las células responsables de ambos procesos son las células precursoras miogénicas (MPCs), pero los mecanismos que las llevan a optar por un camino u otro son aún desconocidos. En este trabajo se estudiaron los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a los procesos de hiperplasia e hipertrofia muscular en el pejerrey bonaerense (Odontesthes bonariensis). Se logró por primera vez en esta especie, realizar cultivos primarios de MPCs a partir de extractos de músculo blanco de juveniles, identificándose 3 poblaciones: 1) células MyoD- pequeñas esférica y con alta relación núcleo/citoplasma; 2) células MyoD+ con las mismas características morfológicas que las células del punto anterior y 3) células MyoD+ de mayor tamaño, baja relación núcleo/citoplasma y forma estrellada. El análisis del estado proliferativo utilizando EdU permitió determinar que las poblaciones identificadas en cultivo primario como MyoD+ son MPCs que se han activado, mientras que las células MyoD- esféricas corresponderían a MPCs quiescentes. A continuación, se estudió el proceso de diferenciación in vitro en cultivos celulares durante 72 hs. Se determinó que inicialmente las MPCs quiescentes presentan forma esférica pequeña. Posteriormente, se activan y expresan MyoD. La expresión de MyoD se sostiene durante el resto del programa de diferenciación y fusión celular. Seguidamente, estas células aumentan su tamaño y emiten proyecciones citoplasmáticas mediante las cuales pueden migrar, adquiriendo forma estrellada. Al completar su diferenciación a miocitos adquieren forma de huso para posteriormente entrar en contacto entre sí y fusionarse formando miotubos multinucleados. El desarrollo del cultivo primario de MPCs nos permitió estudiar, a nivel celular, el fenómeno de crecimiento compensatorio en músculo, el cual consiste en el crecimiento acelerado que puede tener lugar luego de un período de ayuno y posterior realimentación. En Odontesthes bonariensis el ayuno inhibe la hipertrofia muscular pero no tiene efectos sobre la hiperplasia. Con el objetivo de evaluar cómo influye la falta de alimento en la proliferación y diferenciación de células musculares, se ayunaron juveniles de pejerrey y luego se aislaron y analizaron las MPCs in vitro utilizando un medio de cultivo rico en nutrientes para emular la condición de realimentación. Si bien se apreció una reducción significativa de la proliferación celular in vivo durante el ayuno, se determinó que las MPCs aisladas de peces ayunados presentaron una mayor velocidad de diferenciación que las aisladas de peces control, sugiriendo que las MPCs adquieren un condicionamiento metabólico como consecuencia de la privación de alimento que determinaría que al encontrarse con una fuente de energía se induzca rápidamente su diferenciación y fusión. Estos datos fundamentan a nivel celular el aumento de la velocidad de hipertrofia observado en peces realimentados. Adicionalmente, se realizó el análisis transcriptómico por RNAseq del tejido muscular de peces ayunados y peces realimentados, identificándose 2.516 genes expresados diferencialmente. Se determinó que durante el ayuno se reprimen genes asociados a la proliferación celular y a síntesis de matriz extracelular, indicando que el crecimiento muscular se inhibe. Contrariamente, la sobreexpresión de genes que intervienen en el catabolismo de lípidos y proteínas, evidencia la movilización de reservas y componentes celulares hacia la producción de energía en un contexto de carencia de nutrientes externos. En concordancia, se advirtió activada la vía de autofagia, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y la fosforilación oxidativa, lo que aumenta la eficiencia en la utilización de energía. Esto sugiere un cambio de las vías de obtención de ATP, pasando de un metabolismo anaeróbico propio del músculo blanco hacia un metabolismo aeróbico. El hecho de que las células musculares expresen esta maquinaria metabólica altamente eficiente activada al momento de reestablecerse la alimentación, podría justificar el rápido y efectivo aprovechamiento de nutrientes que impulsa la diferenciación de MPCs, permitiendo un súbito crecimiento del tejido muscular por hipertrofia. Este trabajo de tesis sienta de esta forma por primera vez las bases celulares y moleculares para comenzar a comprender el crecimiento compensatorio en el modelo O. bonariensis.Fil: Faggiani, Mariano. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Laboratorio Mixto de Biotecnología Acuática; Argentina

The cellular basis of compensatory muscle growth in the teleost Odontesthes bonariensis

This study evaluates white muscle growth and in vivo cell proliferation during a fasting and refeeding trial, using pejerrey (Odontesthes bonariensis) as animal model, in order to better understand the cellular basis governing catch-up growth. Experiments consisted of two groups of fish, a control group continuously fed ad libitum, and a group fasted for 2 weeks and then fed for another 2 weeks. We examined how the formation of new muscle fibers and their increase in size were related to muscle precursor cell (MPC) proliferation under both experimental conditions. During fasting, the number of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine-positive (EdU+) cells decreased along with myogenic regulatory factor (MRF) mRNA levels related to myoblast proliferation and differentiation, and the muscle stem cell marker Pax7 mRNA level increased. Analysis of myomere cross-sectional area, distribution of muscle fiber sizes and number of fibers per myomere showed that muscle hypertrophy but not hyperplasia was inhibited during fasting. Both higher igf2 mRNA level and the persistence of cell proliferation could be supporting new myofiber formation. In contrast, an exacerbated MPC proliferation occurred during catch-up growth, and this increase in cell number could be contributing to the growth of both pre-existing and newly formed small fibers. The findings that some MPCs proliferate during fasting and that muscle growth mechanisms, hyperplasia and hypertrophy are differentially regulated could help to explain why re-fed fish could grow at faster rates, and why they return to the lost growth trajectory.Fil: Simo, Ignacio. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Laboratorio de Biotecnología Acuática; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; ArgentinaFil: Faggiani, Mariano. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Laboratorio de Biotecnología Acuática; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; ArgentinaFil: Fernandez, Daniel Alfredo. Universidad Nacional de Tierra del Fuego, Antártida e Islas del Atlántico Sur. Instituto de Ciencias Polares, Ambientales y Recursos Naturales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Austral de Investigaciones Científicas; ArgentinaFil: Sciara, Andres Angel. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Laboratorio de Biotecnología Acuática; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario; ArgentinaFil: Arranz, Silvia Eda. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Laboratorio de Biotecnología Acuática; Argentin