Identification and quantification of the expression of toll-like receptors 2, 4 and 9 in the human cutaneous leishmaniasis

Introdução: Um dos primeiros sistemas de defesa contra os microrganismos é a via dos receptores Toll-like (TLRs). A ativação destes receptores leva à síntese de citocinas, dando início à resposta imune inata. Em modelos animais, o TLR2, TLR4 e TLR9 parecem estar relacionados com o reconhecimento de antígenos de Leishmania. A relação entre TLRs e leishmânia pode ser um mecanismo chave no desenvolvimento da doença ou no controle da mesma. Até o momento não existem estudos de TLRs na leishmaniose cutânea humana. Objetivo: Determinar o padrão de expressão e as células associadas com o TLR2, TLR4 e TLR9 na leishmaniose cutânea. O objetivo secundário é correlacionar a quantidade de TLRs com a quantidade de citocinas e células inflamatórias na pele. Métodos: Cem biópsias de pacientes com leishmaniose cutânea causadas por Leishmania (V.) braziliensis foram selecionadas inicialmente. Apenas os casos confirmados (presença de amastigotas no raspado, teste de Montenegro positivo, imunoistoquímica com presença de antígenos de Leishmania e reação em cadeia da polimerase com DNA de Leishmania (V.) braziliensis foram incluídos. Um grupo controle de pele normal foi incluído para comparação (quatro casos). A expressão de TLR2, TLR4 e TLR9 foi determinada por técnica imunoistoquímica, da mesma forma que os fenótipos celulares (células NK, macrófagos, células dendríticas, células CD4 e CD8) e citocinas (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-alfa, IFN-gama). Dupla-marcação foi realizada para identificar as células que expressaram os TLRs analisados. Análise semi-quantitativa foi utilizada para avaliação da expressão de TLRs na epiderme, enquanto na derme foi realizada análise quantitativa. O nível de significância foi estabelecido com p<0,05. Resultados: Doze casos preencheram os critérios de inclusão. Os pacientes eram todos masculinos, com lesões apenas em membros inferiores e mediana de idade de 23 anos [16-47]. A expressão de TLR2, TLR4 e TLR9 na epiderme da pele normal foi alta. Quando comparados com pele normal, tanto TLR4 quanto TLR2 mostraram menor expressão no epitélio dos pacientes com leishmaniose e não houve expressão de TLR9. A média de células expressando TLR2 na derme foi de 136,36±82,46 células/mm2, ao passo que a média de células expressando TLR4 foi de 3,21±4,11 células/mm2. A contagem de TLR9 foi de 86,15±88,36 células/mm2 predominando em áreas de formação de granulomas. A regressão linear não demonstrou relação entre a contagem de células marcadas ou citocinas com TLR2 ou TLR4. O aumento proporcional da expressão de TLR9 relacionou-se com maior expressão de IL-12 e IL-4 (p < 0,05). A dupla marcação demonstrou que os macrófagos expressaram TLR2. A dupla marcação não mostrou expressão de TLR2 nas células dendríticas e nas células NK. Conclusão: A leishmaniose cutânea localizada associa-se com a presença de TLR2, TLR4 e TLR9. No epitélio a expressão de TLR2 e TLR4 em pacientes com leishmaniose está diminuída em relação aos pacientes controles. A expressão do TLR2 na derme é estatisticamente maior que a de TLR4 e TLR9, a qual é expressa pelos macrófagos. A expressão de TLR9 ocorre principalmente nas áreas de granulomas havendo relação com a expressão de IL-12 e IL-4Introduction: One of the first systems of defense against microorganisms is the Toll-like receptors (TLRs) pathway. The activation of these receptors promotes the cytokine synthesis, initiating the innate immune response. In animal models, TLR2, TLR4 and TLR9 appear to be related to the recognition of antigens of Leishmania. The relationship between TLRs and Leishmania can be a key mechanism in the development of the disease or it control. Until now, there are not studies about TLRs in human cutaneous leishmaniasis. Objective: To determine the expression pattern and the cells associated with TLR2, TLR4 and TLR9 in cutaneous leishmaniasis. The secondary objective is to correlate the amount of TLRs with the amount of cytokines and inflammatory cells. Methods: One hundred biopsies from patients with cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (V.) braziliensis were initially selected. Only confirmed cases of cutaneous leishmaniasis were included in the analysis (presence of amastigotes in the scraping, positive Montenegro test, immunohistochemistry with the presence of Leishmania antigens and polymerase chain reaction with DNA from Leishmania (V.) braziliensis. A control group (4 cases) of normal skin was included for comparison. The expression of TLR2, TLR4 and TLR9 was determined by immunohistochemistry, as well as cell phenotypes (NK cells, macrophages, dendritic cells, CD4 and CD8) and cytokines (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-alpha, IFN-gamma). Double-staining was used to determine the cells expressing TLRs. Semi-quantitative analysis was used for evaluation of the expression of TLRs in the epidermis. Quantitative analysis was performed to evaluate the expression in the dermis. The level of significance was defined as p <0.05. Results: 12 cases fulfilled inclusion criteria. The patients were all male, with lesions in lower limbs and median age of 23 years [16-47]. The expression of TLR2 and TLR4 in the epidermis of normal skin was high. When compared with normal skin, TLR2 and TLR4 showed lower expression in the epidermis. There was no expression of TLR9 in the epidermis in cases of cutaneous leishmaniasis and normal skin. The mean number of cells expressing TLR2 in the dermis was 136.36±82.46 cells/mm2, while the average of cells expressing TLR4 was 3.21±4.11 cells/mm2. The count of TLR9 was 86.15±88.36 cells/mm2, and it was found mainly in the areas of granuloma formation. Linear regression showed no relationship between the number of labeled cells or cytokines with TLR2 or TLR4. There was an association between TLR9 and two cytokines (IL-12 and IL-4). This correlation suggested that the proportional increase in the expression of TLR9 was related to greater expression of IL-12 and IL-4 (p<0.05). The double staining showed that macrophages and endothelial cells expressed TLR2. The double staining showed no expression of TLR2 in dendritic cells and NK cells. Conclusion: The localized cutaneous leishmaniasis associated with the presence of TLR2, TLR4 and TLR9. The expression of TLR2 in the dermis was statistically greater than that of TLR4 and TLR9, which is expressed by macrophages. The expression of TLR9 occurs primarily in the areas of granulomas was associated with the expression of IL-12 and IL-

Avaliação da sensibilidade e especificidade dos exames citopatológico e colposcópico em relação ao exame histológico na identificação de lesões intra-epiteliais cervicais Sensibility and specificity of cytology and colposcopy exams with the histological evaluation of cervical intraepithelial lesions

OBJETIVO: Este trabalho teve como objetivo avaliar a concordância dos exames citológico e colposcópico com o resultado da análise histológica, obtida a partir de biópsia colpodirigida. MÉTODOS: Foram selecionadas 80 pacientes do ambulatório de colposcopia do Hospital e Maternidade Santa Brígida de Curitiba, PR. As pacientes foram encaminhadas à colposcopia segundo os seguintes critérios: 1) exames citológicos prévios com resultado anormal, 2) dados clínicos indicativos de alteração ou 3) lesões suspeitas ao exame ginecológico. A análise da significância estatística entre os resultados dos exames foi realizada por meio do teste de Qui-quadrado e foram determinados os valores correspondentes à sensibilidade, especificidade, valor preditivo negativo e valor preditivo positivo de cada método. RESULTADOS: As pacientes apresentaram idade média de 30,2 anos (&plusmn;10,9). A capacidade de identificação da presença de lesão na citologia com relação à histologia foi de 50%. A especificidade da citologia foi de 77%, a sensibilidade de 41%, o valor preditivo positivo de 74% e o valor preditivo negativo de 45%. A capacidade da colposcopia em identificar a presença de lesão foi de 51%. A sensibilidade foi de 96%, a especificidade de 19%, o valor preditivo positivo de 65% e o valor preditivo negativo de 75%. A capacidade dos dois métodos associados de detectar a presença de lesões foi de 63%. CONCLUSÕES: A citologia mostrou-se um exame de alta especificidade, enquanto que a colposcopia das pacientes selecionadas apresentou alta sensibilidade. A associação de colposcopia ao screening feito pela citologia, em pacientes selecionadas, aumenta muito a acurácia do diagnóstico das lesões precursoras do carcinoma do colo uterino.<br>OBJECTIVE:To evaluate the correlation of cytopathological and colposcopycal diagnosis with the histopathological analysis from biopsy.METHODS: 80 patients from the colposcopy ambulatory of the Hospital e Maternidade Santa Brígida de Curitiba, PR, were selected. Those patients were sent to colposcopy under the following criteria: 1) previous abnormal cytopathological exams, 2) Indicative clinical data or, 3) Suspected lesions on gynecological exam. The statistical significance analysis of the results was done using the chi-square test. Sensibility, specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) were also determined.RESULTS: The patients' mean age was 30.2 (&plusmn;10.9). Cytopathological capability of identifying lesions was 50% when compared to histology. Its specificity was 77%, the sensibility 41%, the PPV 74%, and the NPV 45%. Colposcopy capability of identifying lesions was 50%. Its sensibility, specificity, PPV and NPV were 96%, 19%, 65% and 75% respectively. The two methods associated were capable of identifying 63% of the lesions.CONCLUSIONS: Cytopathology was a high specificity exam, while colposcopy from those selected patients had a high sensibility. Colposcopy association with cytopathological screening, on those selected patients, significantly raises the diagnostic accuracy of cervical cancer precursor lesions