Mammalian Spermatogenesis, DNA Repair, Poly(ADP-ribose) Turnover: the State of the Art

DNA repair and poly(ADP-ribosyl)ation system during spermatogenesis under physiological and pathological conditions

The Dichotomy of the Poly(ADP-Ribose) Polymerase-Like Thermozyme from Sulfolobus solfataricus.

The first evidence of an ADP-ribosylating activity in Archaea was obtained in Sulfolobus solfataricus(strain MT-4) where a poly(ADP-ribose) polymerase (PARP)-like thermoprotein, defined with the acronymous PARPSso, was found. Similarly to the eukaryotic counterparts PARPSso cleaves beta-nicotinamide adenine dinucleotide to synthesize oligomers of ADP-ribose; cross-reacts with polyclonal anti-PARP-1 catalytic site antibodies; binds DNA. The main differences rely on the molecular mass (46.5 kDa) and the thermophily of PARPSso which works at 80 °C. Despite the biochemical properties that allow correlating it to PARP enzymes, the N-terminal and partial amino acid sequences available suggest that PARPSso belongs to a different group of enzymes, the DING proteins, an item discussed in detail in this review.This finding makes PARPSso the first example of a DING protein in Archaea and extends the existence of DING proteins into all the biological kingdoms. PARPSsohas a cell peripheral localization, along with the edge of the cell membrane. The ADP-ribosylation reaction is reverted by a poly(ADP-ribose) glycohydrolase-like activity, able to use the eukaryotic poly(ADP-ribose) as a substrate too. Here we overview the research of (ADP-ribosyl)ation in Sulfolobus solfataricus in the past thirty years and discuss the features of PARPSso common with the canonical poly(ADP-ribose) polymerases, and the structure fitting with that of DING proteins

A new facet of ADP-ribosylation reactions: SIRTs and PARPs Interplay

Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD+) is mainly known as coenzyme of redox reactions for energy transduction and is consumed as substrate in regulatory reactions removing nicotinamide and producing ADP-ribose. Several families of ADP-ribose synthesizing enzymes use NAD+ as substrate and control processes like DNA repair, replication and transcription, chromatin structure, the activity of G-proteins and others. Since NAD+-dependent reactions involve degradation of the dinucleotide, a constant supply of the pyridinic substrate is required for its homeostasis. NAD+-dependent signaling reactions include protein deacetylation by sirtuins, intracellular calcium signaling and mono-/poly-ADP-ribosylation. In the context of all NAD+-dependent reactions leading to ADP-ribose synthesis, this review focuses mainly on both the central role played by sirtuins and poly-ADPribose polymerases as cellular NAD+ consumers and their crosstalk in signaling pathways

DANNEGGIAMENTO PER VIA RADICALICA DI PROTEINE CONTENENTI RESIDUI SOLFORATI E FORMAZIONE DI LIPIDI TRANS IN SISTEMI MODELLO

Nel presente lavoro di tesi sono stati studiati sia i cambiamenti strutturali di proteine solforate esposte a radiazioni gamma sia i danni indotti dai radicali tiilici (RS•) da esse generati, sui lipidi insaturi in vescicole unilamellari (LUVET). In particolare, l’inattivazione di queste proteine mediante reazione con l’•H, in condizioni di stress riduttivo, è stata connessa al danno di specifici residui solforati e alla formazione di tioli a basso peso molecolare. Inoltre, lo studio dei cambiamenti strutturali di un’altra proteina, la beta-amiloide (mediante reazione con i radicali NO2• e CO3•– ha dimostrato che nelle condizioni di analisi, la modificazione più importante è l’ossidazione della Met35, a conferma della suscettibilità di questo amminoacido all’attacco da parte di radicali, anche di natura diversa. La gamma-radiolisi di sospensioni di vescicole lipidiche (DOPC, POPC) contenenti proteine solforate (RNasi A, lisozima) e amminonoacidi solforati (Met), è stata poi utilizzata per simulare condizioni di stress radicalico e analizzare il danneggiamento dei lipidi. I modelli biomimetici hanno dimostrato che, quando i tiil radicali sono generati in compartimenti acquosi, possono diffondere nel doppio strato lipidico e, interagendo con il doppio legame degli acidi grassi insaturi, ne catalizzano la conversione da cis a trans. La metionina potrebbe essere, pertanto, la principale fonte di radicali tiilici; in minor misura altri residui solforati. Questo risultato è confermato da una ridotta isomerizzazione cis-trans nei sistemi modello contenenti proteine prive di Met (RNasi T1) o di residui solforati in genere (istone H1). La formazione di tiil radicali per degradazione dei residui solforati può dunque dare inizio ad un danno radicalico tandem che coinvolge contemporaneamente lipidi e proteine

CHROMATIN ARCHITECTURE AND FUNCTIONS: THE ROLE(S) OF POLY(ADP-RIBOSE) POLYMERASE AND POLY(ADPRIBOSYL)ATION OF NUCLEAR PROTEINS.

SPECIAL EPIGENETIC ISSUE Epigenetic states that allow chromatin fidelity inheritance can be mediated by several factors. One of them, histone variants and their modifications (including acetylation, methylation, phosphorylation, poly(ADP-ribosyl)ation, and ubiquitylation) create distinct patterns of signals read by other proteins, and are strictly related to chromatin remodelling, which is necessary for the specific expression of a gene, and for DNA repair, recombination, and replication. In the framework of chromatin-controlling factors, the poly(ADP-ribosyl)ation of nuclear proteins, catalysed by poly(ADP-ribose)polymerases (PARPs), has been implicated in the regulation of both physiological and pathological events (gene expression/amplification, cellular division/differentiation, DNA replication, malignant transformation, and apoptotic cell death). The involvement of PARPs in this scenario has raised doubts about the epigenetic value of poly(ADP-ribosyl)ation, because it is generally activated after DNA damage. However, one emerging view suggests that both the product of this reaction, poly(ADP-ribose), and PARPs, particularly PARP 1, play a fundamental role in recruiting protein targets to specific sites and (or) in interacting physically with structural and regulatory factors, through highly reproducible and inheritable mechanisms, often independent of DNA breaks. The interplay of PARPs with protein factors, and the combinatorial effect of poly(ADPribosyl)ation with other post-translational modifications has shed new light on the potential and versatility of this dynamic reaction

Past and current Topics on ADPribosylation reactions

The milestone of Adenosine Diphosphate-ribosylation studies was the paper by Paul Mandel’s group in 1960s, first describing a “sort” of polyadenylic acid synthesized upon addition of nicotinamide mononucleotide in rat liver nuclear extracts. Nicotinic Acid or Niacin is the precursor of Nicotinamide Adenin Dinucleotide. In 1960s this compound was known mainly as coenzyme of most redox processes in metabolism. The discovery of enzymes that covalently transfer Adenosine Diphosphate-ribose moiety of Nicotinamide Adenin Dinucleotide to acceptor proteins, thereby altering their function, or are able to synthesize cyclic Adenosine Diphosphate-ribose, has given rise to the era of one of the most studied and still surprising reversible post – translational modification reactions. Over 50 years, developing the research on Adenosine Diphosphate-ribosylation has provided the basis to interconnect several processes thought to be very distant each other, opening new perspectives in their regulation and in therapeutic intervention. Here a synthesis of the history and the main and recent goals reached studying Adenosine Diphosphate-ribose in all its features are provided by a series of reviews including the most advanced research

Caratterizzazione strutturale e funzionale di un enzima ADP-ribosilante da S. solfataricus

Dal Sulfolobus e’ stato purificato un enzima ad attivita’ ADPribosilante, termofilico e termostabile, con un optimum di temperatura di 80°C, che condivide con le PARP alcune proprieta’. E’ in grado di cross-reagire con anticorpi diretti contro il sito catalitico di PARP-1, ma non contro il N-terminale, il DNA binding domain, catalizza la reazione di allungamento del ADPR , a formare oligomeri di 5-6 unita’ di adpribosio, interagisce con il DNA. Queste proprieta’ , comuni nelle PARP eucariotiche, rendono particolare l’enzima archeobatterico, essendo questo il primo caso descritto di un’attivita’ poli-adpribosilante di origine procariotica. Questo ci ha portato a dedicare la gran parte delle energie allo studio degli aspetti funzionali dell’enzima e siamo partiti proprio dall’analisi delle proprieta’ di interazione con il DNA. Il DNA di Sulfolobus e’ altamente instabile a temperature superiori a 60°C. La presenza del termozima stabilizza il DNA genomico, aumentandone la Tm; inoltre ha un effetto di protezione in presenza della nucleasi. Dia 47 Analoghi risultati sono stati ottenuti con un plasmide circolare: in presenza dell’enzima, incremento della Tm, formazione di complessi stabili, resistenti alle alte temperature , all’azione di detergenti e delle nucleasi, ma non quando l’enzima e’ degradato dalla proteinasi k. L’attivita’ enzimatica e’ influenzata dal DNA, soprattutto dal genomico. E’ meno sensibile alla forma lineare del plasmide. I risultati ottenuti ci hanno permesso di stabilire che l’enzima lega il DNA con alta affinita’ , ma non specificamente, con una frequenza di 1 molecola di proteina ogni 10 basi. Tra gli accettori proteici e’ una proteina di 7 kDa, la Sso7, che dopo purificazione e’ stata utilizzata per esperimenti di ricostituzione in vitro, sia in forma nativa che ADPribosilata. Qui e’ possibile vedere anche la forma automodificata dell’enzima. La SSo7 rappresenta una famiglia di proteine molto abbondanti in Sulfolobus, ricche in amminoacidi basici, con un motivo strutturale che ricorda le HMG eucariotiche e che hanno la funzione di condensare il DNA. A differenza degli Euriarcheota, i crenarcheota non posseggono proteine di tipo istonico. La disponibilita’ della SSo7 in forma purificata ci ha permesso di condurre una serie di analisi volte a stabilire come variassero le proprieta’ di legame al DNA della SSo7 in forma ADPribosilata. L’attivita’ enzimatica si incrementa di 4 volte in presenza dell’accettore. Quindi la proteina SSo7 rappresenta un accettore di ADPribosio. La conseguenza della modificazione e’ evidente dalle curve di fusione. La SSo7 nativa sposta la Tm del DNA verso le alte temperature, mentre la sua forma ADPribosilata destabilizza considerevolmente l’acido nucleico. In questa direzione sono anche i risultati delle analisi di dicroismo circolare: l’effetto condensante il DNA della proteina basica si traduce in evidente rilassamento dell’acido nucleico se la proteina e’ in forma ADPribosilata. Sulla base di questi risultati si potrebbe ipotizzare un ruolo della PARP di sulfolobus nel rimodellamento della cromatina, ma ancora molto c’e’ da chiarire , soprattutto su come si inserisce questo tipo di regolazione nel contesto dei meccanismi di condensazione del DNA ad oggi dimostrati per gli Archaea

Mammalian spermatogenesis, DNA repair, Poly(ADP-ribose) turnover: the state of the art

DNA repair and poly(ADP-ribosyl)ation system during spermatogenesis under physiological and pathological conditions