Effect of Drying Mode of Bacterial Biomass on the Effectiveness of Extraction and Physicochemical Properties of the Product (Polymer)

Проведено сравнительное исследование различных режимов высушивания биомассы бактерий Cupriavidus eutrophus В10646. Показано, что различные режимы оказывают влияние на выход конечного продукта (полимера) и его физико-химические свойства (молекулярно-массовые и температурные характеристики). Использование высоких температур приводит к деградации полимера и снижению его молекулярной массы. Применение сублимационной сушки позволяет получить рыхлую биомассу с довольно развитой поверхностью, что благоприятно сказывается на процессе экстракции и не приводит к изменению молекулярно-массовых характеристик полимераComparative study of different drying modes of bacterial biomass of Cupriavidus eutrophus В10646 was conducted. Different modes differently affect the yield of the product (polymer) and its physicochemical properties (molecular weight distribution and temperature characteristics). High temperatures caused the polymer degradation and decrease of its molecular weight. Using freeze drying allows to obtain friable biomass with an extended surface which is favorable for extraction process and to preserve the molecular weight characteristics of the polyme

Isolation and Purification of Polyhydroxyalkanoates. Scaling in Pilot Production

Исследован процесс выделения и очистки поли‑3-гидроксибутирата в условиях масштабирования. В качестве солюбилизирующих агентов изучены додецилсульфат натрия, гипохлорит натрия и стиральный порошок «Пемос». Наибольший выход 95 %, и чистота полимера 99,5 % достигнут при использовании двухстадийного метода экстракции и порошка «Пемос» в качестве солюбилизирующего агента. В результате чего удалось снизить затраты на стадии солюбилизации до 31 руб/кг поли‑3-гидроксибутирата. По результатам исследований внесены изменения в аппаратурную и технологическую схему процессаThe process of isolating and purifying poly‑3-hydroxybutyrate under scaling conditions has been studied. Sodium dodecyl sulfate, sodium hypochlorite and Pemos washing powder were studied as solubilizing agents. The highest yield of 95 % and polymer purity of 99.5 % was achieved using a two- stage extraction method and Pemos powder as a solubilizing agent. As a result, it was possible to reduce the costs at the solubilization stage to 31 rubles/kg of poly‑3-hydroxybutyrate. Based on the research results, a technology for the isolation and purification of polyhydroxyalkanoates was propose

Waste Fish Oil is a Promising Substrate for the Synthesis of Target Products of Biotechnology

Жир, полученный из отходов производства консервов прибалтийской кильки (Sprattus sprattus), впервые исследован в качестве углеродного субстрата для синтеза белка одноклеточных и разрушаемых биопластиков полигидроксиалканоатов (ПГА) в культуре трех штаммов бактерий: Cupriavidus necator B‑5786, C. necator B‑8562, C. necator B‑10646. В исследуемом жире общие липиды составили 95 %, белок и углеводы 4 и 1 % соответственно; в составе жирных кислот (ЖК) липидов идентифицировано 16 жирных кислот с доминированием пальмитиновой (28,0 % от суммы ЖК), олеиновой (25,3 % от суммы ЖК), докозагексаеновой (16,7 % от суммы ЖК) кислот. При варьировании режимов выращивания бактерий и изменении концентрации азота в среде показана возможность синтеза белковой биомассы или резервных ПГА. На полной среде все штаммы синтезируют высокобелковую биомассу с содержанием «сырого» протеина и белка не менее 70 и 50 % соответственно с полным набором аминокислот, включая незаменимые. При лимитированном росте бактерий по азоту получены высокие (до 60–70 %) выходы ПГА, представленные 3-х компонентными сополимерами поли(3-гидроксибутират-со‑3- гидроксивалерат-со‑3- гидроксигексаноат) (П(3ГБ‑со‑3ГВ‑со‑3ГГ)) с содержанием 3ГВ и 3ГГ соответственно 0,20–0,31 и 0,04–0,07 мол.% и со значениями средневесовой молекулярной массы не ниже 600 кДа и степенью кристалличности порядка 70 %. Исследованный жиросодержащий отход рыбопереработки можно отнести к перспективному возобновляемому и доступному субстрату для биотехнологического получения белка одноклеточных и биоразрушаемых «зеленых» пластиковFat derived from the waste of the Baltic sprat (Sprattus sprattus) canning industry was studied as a carbon substrate for the synthesis of single cell protein and degradable bioplastics, polyhydroxyalkanoates (PHAs), in the culture of three bacterial strains: Cupriavidus necator B‑5786, C. necator B‑8562, and C. necator B‑10646. The fatty substrate used in the present study contained 95 % of total lipids, 4 % of proteins, and 1 % of carbohydrates. Sixteen fatty acids (FAs) of lipids were identified, with palmitic (28.0 %), oleic (25.3 %), and docosahexaenoic (16.7 %) acids prevailing. The modes of cell cultivation were varied and the concentration of nitrogen in the medium was changed to direct metabolism towards synthesis of single cell protein or reserve PHAs. On complete nutrient medium, all strains synthesized high- protein biomass containing at least 70 and 50 % of “crude” protein and protein, respectively, which were complete in amino acids, including essential ones. When bacterial growth was limited by nitrogen, high (up to 60–70 %) yields of PHAs were obtained. The PHAs were represented by 3-component copolymers poly(3-hydroxybutyrtae-co‑3-hydroxyvalerate-co‑3-hydroxyhaxanoate) (P(3HB‑co‑3HV‑co‑3HHx)) with 0.20–0.31 mol.% of 3HV and 0.04–0.07 mol.% of 3HHx and with a weight average molecular weight of at least 600 kDa and a degree of crystallinity of about 70 %. Based on these parameters, the fat- containing waste of the canning industry can be regarded as a promising renewable substrate for the biotechnological production of single cell protein and biodegradable “green” plastics – polyhydroxyalkanoate

Sugar Beet Molasses as a Potential C-Substrate for PHA Production by Cupriavidus necator

To increase the availability and expand the raw material base, the production of polyhydroxyalkanoates (PHA) by the wild strain Cupriavidus necator B-10646 on hydrolysates of sugar beet molasses was studied. The hydrolysis of molasses was carried out using β-fructofuranosidase, which provides a high conversion of sucrose (88.9%) to hexoses. We showed the necessity to adjust the chemical composition of molasses hydrolysate to balance with the physiological needs of C. necator B-10646 and reduce excess sugars and nitrogen and eliminate phosphorus deficiency. The modes of cultivation of bacteria on diluted hydrolyzed molasses with the controlled feeding of phosphorus and glucose were implemented. Depending on the ratio of sugars introduced into the bacterial culture due to the molasses hydrolysate and glucose additions, the bacterial biomass concentration was obtained from 20–25 to 80–85 g/L with a polymer content up to 80%. The hydrolysates of molasses containing trace amounts of propionate and valerate were used to synthesize a P(3HB-co-3HV) copolymer with minor inclusions of 3-hydroxyvlaerate monomers. The introduction of precursors into the medium ensured the synthesis of copolymers with reduced values of the degree of crystallinity, containing, in addition to 3HB, monomers 3HB, 4HB, or 3HHx in an amount of 12–16 mol.%

Comparative Study of Methods of Pha Extraction from Bacterial Biomass

Проведено сравнительное исследование различных методов экстракции полигидроксиалканоатов (ПГА) из биомассы бактерий. Показано, что различные реагенты и технология ведения процесса по-разному влияют на показатели – полноту извлечения полимера и степень его чистоты. Применение хлороформа делает необходимым использование большого количества летучих и токсичных реагентов. При использовании дихлорметана полнота извлечения повышается, но возникает необходимость в реализации процедуры разделения смеси «экстрагент – осадитель». Подобрана пара «растворитель – осадитель» (дихлорметан – гексан), которая не образует между собой азеотропную смесь, что делает возможным вернуть в процесс до 90 % реагентов. В результате снизился расход растворителей с 73,5 кг/кг ПГА (хлороформ – гексан) до 63,7 кг/кг ПГА (дихлорметан – этанол – гексан). При исключении из состава этанола возможно снижение расхода до 7,8 г/г ПГА, но в этом случае необходима дополнительная обработка биомассы с целью разрушения мембранных комплексов или последовательная обработка сначала спиртом, а затем дихлорметаном. Безреагентный метод с применением в качестве детергента додецилсульфата натрия (ДДС-Na) позволяет более экономичным способом получать высокие выходы полимера, не загрязненного примесями жирных кислот, пригодного для технических целей (тара, упаковочная продукция). Разработан комбинированный метод, который значительно снижает расходы реагентов и позволяет получать полимер высокой чистоты при полноте экстракции до 98,5–99,0 %A comparative study of different methods of PHA extraction from the biomass of bacteria was carried out. It was shown that different reagents and process technologies have different effects on the extraction results – the completeness of polymer extraction and degree of its purity. Application of chloroform requires the use of large amounts of volatile and toxic reagents. When dichloromethane is used, the completeness of extraction increases, but it becomes necessary to implement procedures for separating the “extractant-precipitator” mixture. The solvent-precipitator pair (dichloromethanehexane) was selected, which does not lead to formation of an azeotropic mixture, making it possible to return up to 90 % of the reactants to the process. As a result, solvent consumption went down from 73.5 kg/kg of PHA (chloroform – hexane) to 63.7 kg/kg of PHA (chloroform – ethanol – hexane). If ethanol is excluded, it is possible to reduce the consumption to 7.8 g/g of PHA, but in this case additional treatment of biomass to destroy membrane complexes or sequential treatment first with alcohol and then with dichloromethane is needed. A nonchemical method using sodium dodecyl sulfate (NaDS) as a detergent allows for a more economical way to obtain high yields of polymer not contaminated with admixtures of fatty acids and suitable for technical purposes (packaging, packaging products). A combined method was developed, which considerably reduces the cost of reagents and makes it possible to obtain polymers with high purity degree and extraction completeness up to 98.5–99.0

The Kinetics of Fungicide and Herbicide Release from Slow-Release Formulations Prepared from Degradable Poly-3- Hydroxybutyrate

Проведено исследование кинетики оттока препаратов тебуконазола и метрибузина из полимерных носителей, выполненных из поли-3-гидроксибутирата различной формы: гранулы, пленки и 3D-формы. Выявлены основные закономерности оттока, рассчитаны кинетические константы для модели выхода первого порядка и модели ХигучиRelease kinetics of the fungicide tebuconazole and the herbicide metribuzin from polymeric carriers was investigated. Carriers were prepared from poly-3- hydroxybutyrate as granules, films and 3D forms. The main mechanisms of pesticide release were discovered; kinetic constants for the first order model and Higuchi model were calculate

Comparative Study of Methods of Pha Extraction from Bacterial Biomass

Проведено сравнительное исследование различных методов экстракции полигидроксиалканоатов (ПГА) из биомассы бактерий. Показано, что различные реагенты и технология ведения процесса по-разному влияют на показатели – полноту извлечения полимера и степень его чистоты. Применение хлороформа делает необходимым использование большого количества летучих и токсичных реагентов. При использовании дихлорметана полнота извлечения повышается, но возникает необходимость в реализации процедуры разделения смеси «экстрагент – осадитель». Подобрана пара «растворитель – осадитель» (дихлорметан – гексан), которая не образует между собой азеотропную смесь, что делает возможным вернуть в процесс до 90 % реагентов. В результате снизился расход растворителей с 73,5 кг/кг ПГА (хлороформ – гексан) до 63,7 кг/кг ПГА (дихлорметан – этанол – гексан). При исключении из состава этанола возможно снижение расхода до 7,8 г/г ПГА, но в этом случае необходима дополнительная обработка биомассы с целью разрушения мембранных комплексов или последовательная обработка сначала спиртом, а затем дихлорметаном. Безреагентный метод с применением в качестве детергента додецилсульфата натрия (ДДС-Na) позволяет более экономичным способом получать высокие выходы полимера, не загрязненного примесями жирных кислот, пригодного для технических целей (тара, упаковочная продукция). Разработан комбинированный метод, который значительно снижает расходы реагентов и позволяет получать полимер высокой чистоты при полноте экстракции до 98,5–99,0 %A comparative study of different methods of PHA extraction from the biomass of bacteria was carried out. It was shown that different reagents and process technologies have different effects on the extraction results – the completeness of polymer extraction and degree of its purity. Application of chloroform requires the use of large amounts of volatile and toxic reagents. When dichloromethane is used, the completeness of extraction increases, but it becomes necessary to implement procedures for separating the “extractant-precipitator” mixture. The solvent-precipitator pair (dichloromethanehexane) was selected, which does not lead to formation of an azeotropic mixture, making it possible to return up to 90 % of the reactants to the process. As a result, solvent consumption went down from 73.5 kg/kg of PHA (chloroform – hexane) to 63.7 kg/kg of PHA (chloroform – ethanol – hexane). If ethanol is excluded, it is possible to reduce the consumption to 7.8 g/g of PHA, but in this case additional treatment of biomass to destroy membrane complexes or sequential treatment first with alcohol and then with dichloromethane is needed. A nonchemical method using sodium dodecyl sulfate (NaDS) as a detergent allows for a more economical way to obtain high yields of polymer not contaminated with admixtures of fatty acids and suitable for technical purposes (packaging, packaging products). A combined method was developed, which considerably reduces the cost of reagents and makes it possible to obtain polymers with high purity degree and extraction completeness up to 98.5–99.0

The Kinetics of Fungicide and Herbicide Release from Slow-Release Formulations Prepared from Degradable Poly-3- Hydroxybutyrate

Проведено исследование кинетики оттока препаратов тебуконазола и метрибузина из полимерных носителей, выполненных из поли-3-гидроксибутирата различной формы: гранулы, пленки и 3D-формы. Выявлены основные закономерности оттока, рассчитаны кинетические константы для модели выхода первого порядка и модели ХигучиRelease kinetics of the fungicide tebuconazole and the herbicide metribuzin from polymeric carriers was investigated. Carriers were prepared from poly-3- hydroxybutyrate as granules, films and 3D forms. The main mechanisms of pesticide release were discovered; kinetic constants for the first order model and Higuchi model were calculate

Scaling of Biodegradable Polyhydroxyalkanoates Synthesis Technology in Pilot Production Conditions

На основе экспериментально достигнутых технико-технологических показателей процессов биосинтеза получены исходные данные и разработан проект создания опытного производства разрушаемых полигидрокисалканоатов (ПГА). Сконструировано, укомплектовано и введено в строй пилотное производство полигидроксиалканоатов, включающее ферментационную линию «Bioengineering» (Швейцария) и блоки получения инокулята и питательных сред, выделения и очистки полимеров. Опытное производство введено в строй. При исходной концентрации инокулята (10±2) г/л и длительности культивирования 65 ч конечные концентрации биомассы клеток и полимера в культуре Cupriavidus eutrophus В10646 составили (110±10) г/л и (85±5) % при продуктивности процесса по биомассе и ПГА 1,7 и 1,4 г/л∙ч соответственно, что вдвое превосходит ранее достигнутые показатели в культуре Ralstonia eutrophus B5786 на фруктозе. Масштабирование технологии обеспечило получение опытных партий полимеров в количествах, необходимых для проведения комплекса регламентированных исследований, разработки и стандартизации специализированной полимерной продукцииOn the basis of experimentally achieved and developed technical and technological parameters of biosynthesis processes the baseline data were obtained and the project was worked out for organization of pilot production of degradable polyhydroxyalkanoates (PHAs). The pilot line for production of polyhydroxyalkanoates was designed, equipped and commissioned, including the “Bioengineering” fermentation line (Switzerland), as well as the blocks for preparation of inoculum and culture media, isolation and purification of polymers. The pilot production was commissioned. When the initial concentration of inoculum was (10 ± 2) g/l and the cultivation duration was 65 h, the final concentrations of cells biomass in the culture of Cupriavidus eutrophus В10646 and polymer were (110±10) g/l and (85±5)%, with the process productivity by biomass and PHA of 1.7 and 1.4 g/l∙h, respectively, which is twice as high as the previously achieved results in the culture of Ralstonia eutrophus B5786 on fructose. Scaling the technology made it possible to obtain the experimental batches of polymers in the amounts needed for conducting a complex of prescribed research, development and standardization of specialized polymer product