Stunted microbiota and opportunistic pathogen colonization in caesarean-section birth

Immediately after birth, newborn babies experience rapid colonization by microorganisms from their mothers and the surrounding environment1. Diseases in childhood and later in life are potentially mediated by the perturbation of the colonization of the infant gut microbiota2. However, the effects of delivery via caesarean section on the earliest stages of the acquisition and development of the gut microbiota, during the neonatal period (≤1 month), remain controversial3,4. Here we report the disrupted transmission of maternal Bacteroides strains, and high-level colonization by opportunistic pathogens associated with the hospital environment (including Enterococcus, Enterobacter and Klebsiella species), in babies delivered by caesarean section. These effects were also seen, to a lesser extent, in vaginally delivered babies whose mothers underwent antibiotic prophylaxis and in babies who were not breastfed during the neonatal period. We applied longitudinal sampling and whole-genome shotgun metagenomic analysis to 1,679 gut microbiota samples (taken at several time points during the neonatal period, and in infancy) from 596 full-term babies born in UK hospitals; for a subset of these babies, we collected additional matched samples from mothers (175 mothers paired with 178 babies). This analysis demonstrates that the mode of delivery is a significant factor that affects the composition of the gut microbiota throughout the neonatal period, and into infancy. Matched large-scale culturing and whole-genome sequencing of over 800 bacterial strains from these babies identified virulence factors and clinically relevant antimicrobial resistance in opportunistic pathogens that may predispose individuals to opportunistic infections. Our findings highlight the critical role of the local environment in establishing the gut microbiota in very early life, and identify colonization with antimicrobial-resistance-containing opportunistic pathogens as a previously underappreciated risk factor in hospital births

Non invasive prenatal diagnosis of Down syndrome from maternal blood with methods based on the differential methylation status of fetal and maternal DNA

Down Syndrome (or Trisomy 21) (OMIM190685) has an incidence of 1 in 700 births in all populations worldwide, and is considered to be the most frequent etiology of mental retardation. Non-invasive prenatal screening is currently based on the use of ultrasound scans combined with maternal serum biochemical markers, whereas prenatal diagnosis of high risk pregnancies is performed by karyotyping and/or DNA analysis of fetal cells obtained via chorionic villus sampling, amniocentesis, or cordocentesis. As the above procedures are invasive and associated with ~1% risk of fetal loss, there is an urgent need for the development of accurate, stand-alone non-invasive strategies. Since the discovery of the circulating cell free fetal DNA (cffDNA), which was found to be of placental origin, large scale studies have been ongoing to develop non-invasive prenatal diagnostic methodologies. Recently, our team has combined a newly developed methodology known as Methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) with high-resolution tiling oligonucleotide array, to identify the differences in DNA methylation between maternal and fetal DNA across the chromosomes of interest (chromosomes 13, 18, 21, X and Y). The data generated was used for the development and validation of the first universal non-invasive prenatal diagnosis (NIPD) for trisomy 21, using MeDIP real time qPCR with a selected subset of DMRs on chromosome 21. In this PhD study, we estimated the sensitivity and specificity of the NIPD21 diagnostic test (version 1) with the application of the test on 100 blinded blood samples. The 60 normal and 40 abnormal testing samples are correctly classified showing 100% accuracy. Then, we present new data of our MeDIP real time qPCR NIPD method with an extensive re-evaluation of the efficiency of each DMR included in the discriminant analysis, the development of an improved version (v1.1) of the diagnostic formula, as well as a new and larger validation blind study. The discrimination of normal from trisomy 21 pregnancies is based on the quantification of the extra copy of chromosome 21. Therefore, the regions on chromosome 21 chosen for further investigation should be free of CNVs, as these would interfere with the interpretation of the results and may lead to misdiagnosis. Upon searching the DGV database, we initially investigated whether the 12 selected DMRs are located within regions of known CNVs. The results showed that four out of the 12 DMRs are located within chromosomal regions with CNVs. EP8 and EP11 were used for the construction of the first diagnostic formula (version 1) and therefore it was necessary to revise the original diagnostic formula (version 1.1) by excluding the DMRs located within CNVs.The DMRs which were free of CNVs or segmental duplications were used to design the new diagnostic formula, version 1.1 (v1.1). The implementation of the discriminant analysis of 75 cases showed that seven out of the eight - free of CNVs - DMRs, entered the final model of the prediction equation (diagnostic formula). A validation blind study was performed on 100 additional samples including 25 trisomy 21 cases and 75 normal cases. The results showed 99.2% specificity with 95% CI [95.62, 99.98] and 100% sensitivity with 95%CI [92.89, 100.00] of our NIPD21. All cases were correctly classified with the exception of one normal sample which gave a grey zone-false positive result. In addition to the above, we extensively examined, based on very strict criteria, more than 2000 DMRs on chromosome 21 to reassure that the DMRs used in our method are the best and to create a group of DMRs available for further examination of inconclusive cases.Furthermore, we tried to evaluate and optimize the protocol of the method. We managed to omit the LM-PCR step by using absolute quantification instead of relative quantification and to merge time consuming stages of the MeDIP. We also applied the NIPD21 on plasma samples instead of whole blood samples and we replaced the EDTA tubes by alternative tubes with better results. Finally, we made some constructive changes to the protocols, the equipment and the enzymes used in the test to reduce the time, the cost and the labor.The MeDIP real-time qPCR-based approach (version 1.1) is in advantage compared to the other technologies provided as it is more accurate, sensitive, faster, simpler and cost-effective. We speculate that NIPD tests will soon expand to other common and rare causative copy number change (CNV) and mutation-associated diseases, such as aneuploidies for chromosomes 13, 18, X and Y, small size rearrangements and diseases caused by single gene mutations.Το σύνδρομο Down (ή Τρισωμία 21) (OMIM190685) θεωρείται η συχνότερη αιτία διανοητικής καθυστέρησης με συχνότητα εμφάνισης 1 στις 700 γεννήσεις σε όλους τους πληθυσμούς παγκοσμίως. Ο μη επεμβατικός προγεννητικός έλεγχος του συνδρόμου Down στις μέρες μας στηρίζεται στη χρήση υπερήχων σε συνδυασμό με τη μέτρηση βιοχημικών δεικτών στο μητρικό ορό, ενώ η προγεννητική διάγνωση στις περιπτώσεις κυήσεων υψηλού κινδύνου πραγματοποιείται με τον καρυότυπο και/ή την DNA ανάλυση εμβρυϊκών κυττάρων που απομονώνονται με τη λήψη χοριονικών λαχνών, την αμνιοπαρακέντηση ή την ομφαλοκέντηση. Οι διαδικασίες αυτές είναι επεμβατικές και σχετίζονται με ~1% κίνδυνο αποβολής. Για το λόγο αυτό, η ανάπτυξη μη επεμβατικών στρατηγικών που να δίνουν ακριβή και ασφαλή αποτελέσματα χωρίς να χρειάζονται περαιτέρω επιβεβαίωση είναι αναγκαία και υψίστης σημασίας. Η ανακάλυψη εξωκυτταρικού εμβρυϊκού DNA (cff-DNA : cell free fetal DNA) στη μητρική κυκλοφορία και η διαπίστωση ότι προέρχεται από κύτταρα πλακούντα (τροφοβλάστης) που υφίστανται απόπτωση έθεσαν τις βάσεις για την ανάπτυξη μη επεμβατικών προγεννητικών διαγνωστικών μεθοδολογιών. Προσφάτως, η ομάδα μας συνδύασε μια καινούρια μεθοδολογία γνωστή ως ανοσοκατακρήμνιση μεθυλιωμένου DNA (MeDIP) με μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων υψηλής ευκρίνειας (high-resolution tiling oligonoucleotide array) και ταυτοποίησε περισσότερες από 2000 διαφορικά μεθυλιωμένες DNA περιοχές (DMRs) κατά μήκος του χρωμοσώματος 21 μεταξύ εμβρύου και μητέρας. 12 DMRs που πληρούσαν κάποια βασικά κριτήρια επιλέχθηκαν για περαιτέρω διερεύνηση και τελικά 8 απ’ αυτές χρησιμοποιήθηκαν για το στήσιμο του πρώτου καθολικού μη επεμβατικού προγεννητικού διαγνωστικού τεστ για την τρισωμία 21 (NIPD21). Το τεστ αυτό στηριζόταν στην εφαρμογή των τεχνικών «MeDIP» και «ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου». Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αρχικά εκτιμήσαμε με ακρίβεια την ευαισθησία και την ειδικότητα του NIPD21 διαγνωστικού τεστ (έκδοση 1) προκειμένου να επιβεβαιώσουμε ότι πρόκειται για μια πολύ αξιόπιστη και ασφαλή μέθοδο που μπορεί και αξίζει να χρησιμοποιηθεί στην κλινική έρευνα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε 100 κωδικοποιημένα δείγματα αίματος. Τόσο τα 60 φυσιολογικά όσο και τα 40 παθολογικά δείγματα που εξετάσαμε ταξινομήθηκαν σωστά επιδεικνύοντας 100% ευαισθησία και 100% ειδικότητα για το NIPD21 τεστ (έκδοση 1). Έπειτα, μελετήσαμε εκτενώς τα χαρακτηριστικά καθεμιάς από τις 12 διαφορικά μεθυλιωμένες περιοχές (DMRs) που είχαν επιλεγεί αρχικά για να είμαστε σίγουροι ότι εξετάζουμε τις καλύτερες δυνατές περιοχές. Η διάκριση μεταξύ φυσιολογικών εγκυμοσυνών και εγκυμοσυνών με τρισωμία 21 βασίζεται στην ποσοτικοποίηση του επιπλέον αντιγράφου του χρωμοσώματος 21 και η ύπαρξη CNVs θα μπορούσε να επηρεάσει την ερμηνεία των αποτελεσμάτων και να οδηγήσει σε εσφαλμένη διάγνωση. Συνεπώς, δεν παραλείψαμε να διερευνήσουμε αν οι 8 DMRs του χρωμοσώματος 21 είναι ελεύθερες από πολυμορφισμούς αριθμού αντιγράφων (CNVs) ή όχι. Χρησιμοποιώντας την DGV βάση δεδομένων, διαπιστώσαμε ότι 2 από τις 8 DMRs βρίσκονται εντός χρωμοσωμικών περιοχών με CNVs και έπρεπε να απομακρυνθούν. Στη θέση τους μπήκε μια άλλη DMR ελεύθερη από πολυμορφισμούς (CNVs ή τμηματικούς διπλασιασμούς). Ακολούθησε επαναξιολόγηση της απόδοσης των 7 DMRs που απέμειναν και κατασκευή καινούριας εξίσωσης διάγνωσης (έκδοση 1.1). Για το σκοπό αυτό, εφαρμόστηκε η ανάλυση διάκρισης ( discriminant analysis ) σε 75 περιστατικά με γνωστό καρυότυπο (50 φυσιολογικά και 25 παθολογικά). Το κέρδος από αυτή την αλλαγή στη μέθοδο είναι διπλό. Δημιουργήθηκε ένα νέο τεστ απαλλαγμένο από πολυμορφικές περιοχές, όπου συμμετέχουν λιγότερες περιοχές διαφορικής μεθυλίωσης μειώνοντας το κόστος, τον κόπο και το χρόνο εξαγωγής αποτελέσματος, αφού απαιτούνται λιγότερες αντιδράσεις ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου. Μετά από την απομάκρυνση των δυο DMRs και την εισαγωγή μιας καινούριας, η ευαισθησία και η ειδικότητα του NIPD21 τεστ (έκδοση 1.1) έπρεπε να υπολογιστεί ξανά ούτως ώστε να εξασφαλίσουμε ότι δε μειώθηκε δραματικά η διακριτική ικανότητα του τεστ μεταξύ φυσιολογικών και παθολογικών δειγμάτων. Στην προσπάθεια αυτή, χρησιμοποιηθήκαν 100 επιπλέον δείγματα με κρυφό καρυότυπο για να μην υπάρχει προκατάληψη. Η νέα και εκτενέστερη μελέτη επικύρωσης ( validation blind study ) έδειξε 99.2% ειδικότητα με 95% CI [95.62, 99.98] και 100% ευαισθησία με 95%CI [92.89, 100.00] για την NIPD21 μέθοδό μας. Ειδικότερα, τα 25 δείγματα με τρισωμία 21 και τα 74 από τα 75 φυσιολογικά δείγματα που εξετάστηκαν κατατάχθηκαν σωστά, ενώ ένα από τα 75 φυσιολογικά έδωσε οριακά ψευδώς θετική τιμή. Παράλληλα με την εκτενή μελέτη των 12 διαφορικά μεθυλιωμένων περιοχών που είχαν επιλεγεί στο παρελθόν από την ομάδα μας, εξετάσαμε μία προς μία πάνω τις υπόλοιπες 2000 υποψήφιες DMRs που προέκυψαν από την εφαρμογή των μικροσυστοιχιών ολιγονουκλεοτιδίων υψηλής ευκρίνειας με σκοπό να δημιουργήσουμε ένα σύνολο διαφορικά μεθυλιωμένων περιοχών που δε θα συμμετέχουν στην εξίσωση πρόγνωσης 1.1, αλλά από το οποίο θα μπορούμε να αντλούμε επιπρόσθετες περιοχές για περαιτέρω διερεύνηση σε περιπτώσεις ασαφών περιστατικών με οριακές τιμές πρόγνωσης. Τα κριτήρια που θέσαμε ήταν πολύ αυστηρά με αποτέλεσμα μόλις το 2.5% να προχωρήσει σε περαιτέρω διερεύνηση.Επίσης, αξιολογήσαμε και βελτιστοποιήσαμε το πρωτόκολλο της μεθόδου. Καταφέραμε να αφαιρέσουμε το στάδιο της ενίσχυσης μέσω LM-PCR με τη χρήση απόλυτης αντί για σχετικής ποσοτικοποίησης και να συμπτύξουμε χρονοβόρα στάδια της MeDIP. Ακόμα, εφαρμόσαμε το NIPD21 σε μητρικό πλάσμα αντί για ολικό περιφερικό αίμα όπου τα ποσοστά cff-DNA είναι υψηλότερα και αντικαταστήσαμε τα EDTA σωληνάκια συλλογής αίματος από εναλλακτικά βελτιώνοντας εντυπωσιακά τα αποτελέσματα. Τέλος, κάναμε κάποιες εποικοδομητικές αλλαγές στο πρωτόκολλο, στον απαιτούμενο εξοπλισμό και στα ένζυμα που χρησιμοποιούνται καταφέρνοντας να μειώσουμε το χρόνο, το κόστος και τον κόπο. Είναι σαφές πλέον ότι η μέθοδός μας θα μπορεί να εφαρμοστεί για όλα τα δείγματα ανεξαρτήτως φύλου ή ύπαρξης συγκεκριμένων πολυμορφισμών (SNPs), σε όλα τα εργαστήρια παγκοσμίως εύκολα, με πολύ χαμηλό κόστος, χωρίς να απαιτείται ιδιαίτερα εξειδικευμένο προσωπικό και ακριβός εξοπλισμός, ενώ η διεξαγωγή του αποτελέσματος θα είναι δυνατή σε λιγότερο από 3 μέρες