Maduración in vitro de ovocitos humanos desestimados de ciclos de estimulación ovárica

El éxito de las técnicas de reproducción asistida está directamente relacionado con el número y grado de madurez de los ovocitos recuperados tras la punción folicular, siendo únicamente útiles reproductivamente, aquéllos maduros en estadio de MII; existiendo un 11% en estadio inmaduro (VG) y, por tanto, no útiles reproductivamente. Por ello, planteamos el rescate de ovocitos inmaduros en estadio VG como estrategia reproductiva a fin de aumentar el número de ovocitos iniciales. El objetivo de esta tesis es optimizar las tasas de maduración in vitro (MIV) a nivel nuclear, citoplasmático y genómico de los ovocitos humanos en estadio de VG, recuperados en ciclos de estimulación ovárica controlada con indicación de ICSI. Para ello se han realizado 3 estudios. En el primero, se evaluó la correlación de ciertos parámetros morfométricos y morfológicos no invasivos con la condensación y distribución de la cromatina, en relación al nucléolo. Tras analizar 131 VG, éstas se agruparon retrospectivamente en 3 modelos y las variables morfométricas y morfológicas comparadas. Tras agrupar las VG en función de la condensación de la cromatina, se observó que las variables: diámetro ovocitario, continuidad de la envoltura nuclear, posición del nucléolo y apariencia del nucleoplasma permitieron predecir, mediante un modelo matemático, el grado de condensación de la cromatina, manteniendo la viabilidad del ovocito. En el segundo estudio, se evaluó la maduración ovocitaria in vitro y su correlación con el grado de condensación de la cromatina. Para ello, 131 VG fueron cultivadas en un sistema convencional (SC) y, el grado de maduración nuclear alcanzado evaluado a intervalos regulares de tiempo. Tras 24h, la tasa de maduración nuclear, o capacidad de los ovocitos VG para progresar in vitro a MII, fue del 55%, aumentando al 75% tras prolongar el cultivo hasta 42h. Respecto a la competencia citoplasmática, o capacidad de los ovocitos MII de responder a un procedimiento de activación ovocitaria artificial, un 64% de los ovocitos MIV activó, porcentaje significativamente inferior al observado en ovocitos control (100%). Igualmente, la tasa de activación normal, fue significativamente inferior en el grupo de MIV (22.4% vs. 79.2%). Respeto a la competencia genómica o determinación de la ploidía por FISH observamos que todos los ovocitos con respuesta normal fueron haploides. Finalmente, tras aplicar el modelo matemático predictivo del grado de condensación de la cromatina, observamos que esta variable no muestra relación alguna con la competencia nuclear, citoplasmática o genómica de los ovocitos VG, posiblemente debido a la homogeneidad de la población, en términos de condensación de la cromatina. En el tercero estudio, se describió la cinética de la maduración nuclear in vitro y su correlación con la competencia citoplasmática. Las VG cultivadas en sistema time-lapse (STL) mostraron una tasa de maduración nuclear superior a la obtenida tras cultivo en SC (88.9% vs. 74.8%); además, su competencia citoplasmática fue también superior (STL: 43.4% vs SC: 22.4%) siendo, no obstante, inferiores a las observadas en ovocitos madurados in vivo (control: 79.2%). El análisis de la cinética de la maduración nuclear y su comparación con las tasas de activación total y normal permitió definir dos subpoblaciones ovocitarias en función del tiempo necesario para madurar: E-IVM≤22.0h y L-IMV>22.0h. Los ovocitos E-IVM presentaron una tasa de activación normal comparable a la obtenida en los ovocitos control (61.3% y 79.2%, respectivamente), y significativamente mayor la observada en los ovocitos L-IVM (34.6%). La descripción cinética de la maduración nuclear de estas dos subpoblaciones de VG, reveló que el tiempo requerido por las VG para progresar a MII depende del tiempo de permanencia en estadio de VG, mostrando una duración de secuestro en MI constante y estimada en 14 horas. Por su parte, tras evaluar el efecto de la edad post-metafásica sobre la tasa y tipo de activación, se observó que en los ovocitos E-IVM, una edad post-metafásica igual o inferior a 4.3h, incrementó las tasas totales de activación, pero careciendo de efecto sobre el tipo de activación; no observándose efecto alguno de la edad post-metafásica sobre las tasas y tipo de activación en los L-IVM. Por todo ello, concluimos que, es posible madurar in vitro ovocitos VG recuperados en ciclos de estimulación ovárica controlada con indicación de ICSI. Además, es posible seleccionar de entre los ovocitos madurados in vitro aquéllos óptimos en términos de competencia citoplasmática y genómica, considerando los tiempos totales de maduración a MII y edades post-metafásicas