Function and molecular interactions of Erv1 sulfhydryl oxidase in yeast mitochondria

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells as they play a central role in many cellular procedures as respiration, ATP production and apoptosis. Biogenesis of mitochondria depends on mitochondrial protein import performed by different import pathways. Recently, MIA pathway has been described as a disulfide oxidative system in Saccharomyces cerevisiae that gives disulfides in a variety of different proteins in the mitochondrial intermembrane space (IMS). Functionallity of this pathway depends on two proteins: the sulfhydryl oxidase Erv1/ALR and the oxidoreductase Mia40, that together drive the import of preproteins with conserved cysteines, into the IMS through their oxidative folding. In this PhD thesis, we study the Mia40-Erv1 bimodal interaction by mainly biochemical, in organello, in vitro and in vivo approaches, that occurs in two different steps: (a) Erv1, gets recognized and oxidized by Mia40, as a substrate of MIA pathway (Step A) and (b) folded and functional Erv1 oxidizes the active site of Mia40 (Step B). Studying the import and maturation of Erv1 (Step A) we characterized the minimal region in its carboxyl-terminal part that is required for its recognition and oxidation by Mia40 before the subsequent binding of FAD molecule per its monomer. On the other hand, studying the role of Erv1 in Mia40 re-oxidation (Step B) we found that certain hydrophobic residues downstream of the cysteine motif CRSC N-terminally of Erv1 are required for Mia40 recycling, but not for its mitochondrial import. Moreover, our results showed the part of the first 72 largely unstructured amino acids of Erv1 (N72) shows a targeting role in cytosol, apart from its role in Mia40 re-oxidation. This compartment-dependent redox control of the amino-terminal part of Erv1 raises additional questions concerning its interaction with the outer mitochondrial membrane as well as cytosolic chaperones. The above results give us more information in the field of mitochondrial import in order to study in more detail the Mia40-Erv1 molecular interaction which is crucial for the Erv1 biogenesis, the function of the MIA pathway and hence for the mitochondrial biogenesis and cell viability.Τα μιτοχόνδρια αποτελούν σημαντικά οργανίδια των ευκαρυωτικών κυττάρων καθώς παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλές κυτταρικές διαδικασίες όπως στην αναπνοή, στην παραγωγή ΑΤΡ και στην απόπτωση. Η βιογένεση των μιτοχονδρίων εξαρτάται από την εισαγωγή πρωτεϊνών στο μιτοχόνδριο που πραγματοποιείται μέσω διαφορετικών μονοπατιών εισόδου. Πρόσφατα, το μονοπάτι MIA (Mitochondrial Intermembrane space import and Assembly) έχει περιγραφεί ως ένα σύστημα οξείδωσης δισουλφιδίων στον οργανισμό Saccharomyces cerevisiae που δίνει δισουλφιδικούς δεσμούς σε μια ποικιλία διαφορετικών πρωτεϊνών στο διαμεμβρανικό χώρο των μιτοχονδρίων (IMS). Η λειτουργία αυτού του μονοπατιού εξαρτάται από δύο πρωτεΐνες: την σουλφυδριλοξειδάση Erv1/ALR και την οξειδορεδουκτάση Mia40, που μαζί οδηγούν την είσοδο πρόδρομων πρωτεϊνικών μορίων τα οποία φέρουν συντηρημένες κυστεΐνες, στο IMS μέσω της οξειδωτικής τους αναδίπλωσης.Σε αυτή τη διδακτορική διατριβή, μελετάμε την διττή αλληλεπίδραση μεταξύ των Mia40-Erv1 με βιοχημικές, in organello, in vitro και in vivo προσεγγίσεις, η οποία συμβαίνει σε δύο στάδια: (α) η Erv1, αναγνωρίζεται και οξειδώνεται απο τη Mia40, ως υπόστρωμα του MIA μονοπατιού (Στάδιο Α) και (β) η αναδιπλωμένη και λειτουργική Erv1 οξειδώνει το ενεργό κέντρο της Mia40 (Στάδιο Β). Μελετώντας την είσοδο και την ωρίμανση της Erv1 (Στάδιο Α) χαρακτηρίσαμε την ελάχιστη περιοχή στο καρβοξυτελικό της άκρο που απαιτείται για την αναγνώριση και την οξείδωσή της από τη Mia40 πριν από την μεταγενέστερη πρόσδεση ενός μορίου FAD ανά μονομερές. Απο την άλλη πλευρά, μελετώντας το ρόλο της Erv1 στην επανοξείδωση της Mia40 (Στάδιο Β) βρήκαμε ότι συγκεκριμένα υδρόφοβα αμινοξικά κατάλοιπα καθοδικά του CRSC μοτίβου κυστεϊνών στο αμινοτελικό άκρο της Erv1, απαιτούνται για την ανακύκλωση της Mia40, αλλά όχι για την εισαγωγή της στο μιτοχόνδριο. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι το σε μεγάλο βαθμό αδόμητο κομμάτι των πρώτων 72 αμινοξέων της Erv1 (N72) εμφανίζεται στο κυτοσόλιο να παίζει ρόλο στη στόχευση της πρωτεΐνης στα μιτοχόνδρια, πέρα απο το ρόλο του στην επανοξείδωση της Mia40. Αυτός ο εξαρτώμενος απο το υποκυτταρικό διαμέρισμα οξειδοαναγωγικός έλεγχος του αμινοτελικού κομματιού της Erv1 γεννά πρόσθετα ερωτήματα σχετικά με την αλληλεπίδρασή του με την εξωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων καθώς και με σαπερόνες του κυτοσολίου. Τα παραπάνω αποτελέσματα μας δίνουν περισσότερη πληροφορία στο πεδίο της εισόδου πρωτεϊνών στο μιτοχόνδριο προκειμένου να μελετήσουμε σε μεγαλύτερη λεπτομέρεια την αλληλεπίδραση Mia40-Erv1, η οποία είναι ζωτικής σημασίας για τη βιογένεση της Erv1, τη λειτουργία του ΜΙΑ μονοπατιού και επομένως για τη βιογένεση των μιτοχονδρίων και τη βιωσιμότητα των κυττάρων

Targeting and maturation of Erv1/ALR in the mitochondrial intermembrane space

The interaction of Mia40 with Erv1/ALR is central to the oxidative protein folding in the intermembrane space of mitochondria (IMS) as Erv1/ALR oxidizes reduced Mia40 to restore its functional state. Here we address the role of Mia40 in the import and maturation of Erv1/ALR. The C-terminal FAD-binding domain of Erv1/ALR has an essential role in the import process by creating a transient intermolecular disulfide bond with Mia40. The action of Mia40 is selective for the formation of both intra and intersubunit structural disulfide bonds of Erv1/ALR, but the complete maturation process requires additional binding of FAD. Both of these events must follow a specific sequential order to allow Erv1/ALR to reach the fully functional state, illustrating a new paradigm for protein maturation in the IMS

Autophagy regulates neuronal excitability by controlling cAMP/protein kinase A signaling at the synapse

Autophagy provides nutrients during starvation and eliminates detrimental cellular components. However, accumulating evidence indicates that autophagy is not merely a housekeeping process. Here, by combining mouse models of neuron-specific ATG5 deficiency in either excitatory or inhibitory neurons with quantitative proteomics, high-content microscopy, and live-imaging approaches, we show that autophagy protein ATG5 functions in neurons to regulate cAMP-dependent protein kinase A (PKA)-mediated phosphorylation of a synapse-confined proteome. This function of ATG5 is independent of bulk turnover of synaptic proteins and requires the targeting of PKA inhibitory R1 subunits to autophagosomes. Neuronal loss of ATG5 causes synaptic accumulation of PKA-R1, which sequesters the PKA catalytic subunit and diminishes cAMP/PKA-dependent phosphorylation of postsynaptic cytoskeletal proteins that mediate AMPAR trafficking. Furthermore, ATG5 deletion in glutamatergic neurons augments AMPAR-dependent excitatory neurotransmission and causes the appearance of spontaneous recurrent seizures in mice. Our findings identify a novel role of autophagy in regulating PKA signaling at glutamatergic synapses and suggest the PKA as a target for restoration of synaptic function in neurodegenerative conditions with autophagy dysfunction

Common players in mitochondria biogenesis and neuronal protection against stress-induced apoptosis

Mitochondria biogenesis is a fundamental process for the organization and normal function of all cells. Since the majority of mitochondrial proteins are synthesized in the cytosol, protein import is the major mechanism for mitochondria biogenesis. We describe the different pathways that ensure correct targeting and intra mitochondrial sorting of mitochondrial proteins. The import process of several proteins of the mitochondrial intermembrane space relies on the Mitochondrial Import and Assembly 40 and Essential for respiration and vegetative growth 1 (Erv1) proteins that together constitute the oxidative folding machinery of the mitochondrial intermembrane space. Recent work has implicated the FAD-oxidase protein Erv1 (ad its human homolog Augmenter of Liver Regeneration) as an anti-apoptotic factor in mammalian cells (including neuronal cells) that undergo Reactive Oxygen Species-triggered apoptosis. The different roles of this protein as a key factor in mitochondria biogenesis, iron-sulfur cluster biogenesis and in neuronal protection against apoptosis are discussed