On-line derivatizering van peptiden voor verbeterde sequentieanalyse met microkolom LC-ESI-tandem massaspectrometrie

Een on-line methode is ontwikkeld voor een gecombineerde derivatisering en analyse met behulp van LC-ESI/MS van peptides op femto-mol niveau. Peptides werden na belading op een trapkolom in een microkolom schakelsysteem gederivatiseerd met N-succinimidyl-2(3-pyridyl)acetate (SPA) in gebufferd aqueous medium by pH 7. Het gemakkelijk hydrolyseerbare reagens was opgelost in droge methanol en werd vervolgens in het HPLC systeem gemengd in een 3% volume ratio met de buffer en vervolgens over het monster op de trapkolom geleid. Na de reactie en het wassen van de voorkolom met water werden de reactieproducten (derivaten) met behulp van een gradientelutie van de trapkolom overgebracht naar de analytische kolom voor scheiding en ESI tandam MS analyse. Een vrijwel kwantitatieve reactie vond plaats met N-terminale en lysine amino groepen. De reactie met de lysine aminogroep verschaft een doeltreffende chemische methode voor differentiatie tussen de isobare residuen glutamine en lysine. In een aantal gevallen vond een geringe reactie plaats met de phenolische OH groep van tyrosine. De pyridylacetyl groep op de N-terminale aminogroep kan leiden tot een verandering van het fragmentatiepatroon in MS/MS ten gunste van de vorming van zogenaamde, hetgeen aanvullende informatie levert in MS/MS spectra in sequentie-analyses.An on-line method has been developed for the derivatization and LC-ESI/MS analysis of peptides at the femto-mol level. Peptides were reacted with N-succinimidyl-2(3- pyridyl)acetate (SPA) in buffered aqueous medium at pH 7 following loading on a precolumn (PC) in a microcolumn switching system. The fast hydrolysing reagent was solved in dry methanol and mixed in a 3 vol% ratio with a buffer just before reaching the sample on the PC. Following the reaction and wash, the N-pyridylacetyl (PA) derivatives formed were transferred to the analytical micro-HPLC column for separation and subsequent ESI tandem MS analysis. The reaction was nearly quantitative and takes selectively place at the N-terminal and lysine amino functions, the latter providing a chemical means to distinguish between isobaric residues lysine (K) and glutamine (Q) in peptide sequencing. In some cases, a minor reaction was observed with the tyrosine hydroxyl group. The N-terminal PA groups was capable to alter the collision induced fragmentation (CID) pathway of peptides in favour to the formation of abundant b-type ions, a helpful feature for sequence elucidation of unknown peptides, particularly for quadrupole ion trap instruments.RIV

Identificatie van MHC klasse I geassocieerde antigeenpeptiden. Ontwikkeling van gevoelige massaspectrometrische sequentie analysetechnieken

Betreft de ontwikkeling van gevoelige microkolom HPLC-ESI/MS methoden en technieken voor de analyse van MHC klasse I geassocieerde antigeenpeptiden. De analyse bestaat uit de identificatie van T-cel stimulerende peptiden in MHC elutiemengsels van geinfecteerde celkweekculturen gevolgd door de bepaling van de aminozuurvolgorde (sequentie) van deze peptiden. Elutiemengsels van MHC moleculen kunnen zeer grote aantallen (tot 2000) verschillende peptiden bevatten met sterk wisselende samenstelling afhankelijk van te onderzoeken cellijnen of weefselmateriaal. Beschikbare hoeveelheden van individuele peptiden in dergelijke mengsels voor onderzoek liggen in de femtomol (10 exp. -10) tot picomol (10 exp. -12) range per miljard cellen. HPLC-ESI/MS wordt als de meest geschikte techniek beschouwd voor deze toepassing. In dit onderzoek is microkolom HPLC schakeltechniek ontwikkeld ; de condities zijn aangepast voor een optimale gevoeligheid in ESI-MS. De hiermee behaalde gevoeligheden liggen tussen 10 en 50 fmol voor identificatiedoeleinden (molecuulgewichtbepaling), afhankelijk van aard en soort peptide. Sequentie-analyses vergen circa tien keer grotere hoeveelheden (100-500 fmol/peptide). Dit komt overeen met de hoeveelheden antigeenpeptiden in middelgrote celkweken (10 exp. 10 cellen).The development of methods and techniques for the sensitive analysis of MHC class I associated peptides has been described. Analysis concerns the identification and sequence determination of specific T-cel stimulating antigenic peptides in complex mixtures derived from cell cultures. Such mixtures comprise a few hundreds to thousand different class I peptides present at femtomol (10 exp. -15) to picomol (10 exp. -12) level per billion cells. Liquid chromatography-electrospray ionisation mass spectrometry has emerged as the most appropriate technique for such analysis. For this purpose, a micro-column switching technique has been developed; conditions were optimised directed to large volume sample introduction, concentration and separation for their sensitive analysis at suitable ESI conditions. The sensitivity of the method for molecular weight determination (identification) range between 10 and 50 fmol for individual peptides. Sequence analysis required a ten-fold higher amount of peptide, but is sufficiently low for application to amounts that can be made available from medium size cell cultures of typically 10 exp. 10 cells.RIV

Identification of MHC class I associated peptides. Development of sensitive mass spectrometric sequence analysis techniques

Betreft de ontwikkeling van gevoelige microkolom HPLC-ESI/MS methoden en technieken voor de analyse van MHC klasse I geassocieerde antigeenpeptiden. De analyse bestaat uit de identificatie van T-cel stimulerende peptiden in MHC elutiemengsels van geinfecteerde celkweekculturen gevolgd door de bepaling van de aminozuurvolgorde (sequentie) van deze peptiden. Elutiemengsels van MHC moleculen kunnen zeer grote aantallen (tot 2000) verschillende peptiden bevatten met sterk wisselende samenstelling afhankelijk van te onderzoeken cellijnen of weefselmateriaal. Beschikbare hoeveelheden van individuele peptiden in dergelijke mengsels voor onderzoek liggen in de femtomol (10 exp. -10) tot picomol (10 exp. -12) range per miljard cellen. HPLC-ESI/MS wordt als de meest geschikte techniek beschouwd voor deze toepassing. In dit onderzoek is microkolom HPLC schakeltechniek ontwikkeld ; de condities zijn aangepast voor een optimale gevoeligheid in ESI-MS. De hiermee behaalde gevoeligheden liggen tussen 10 en 50 fmol voor identificatiedoeleinden (molecuulgewichtbepaling), afhankelijk van aard en soort peptide. Sequentie-analyses vergen circa tien keer grotere hoeveelheden (100-500 fmol/peptide). Dit komt overeen met de hoeveelheden antigeenpeptiden in middelgrote celkweken (10 exp. 10 cellen).<br

Evaluation RIVM Strategic Research 2011-2014 : Ready for the challenges of tomorrow

Dit rapport beschrijft de resultaten van het Strategisch Onderzoek RIVM (SOR) programma 2011-2014. Het SOR-budget is bedoeld om het RIVM te voorzien van de benodigde expertise en kwaliteit. Daarmee kan het nu en in de toekomst zijn taken goed uitvoeren en zo bijdragen aan een gezonde bevolking in een gezonde leefomgeving. SOR-projecten worden in een cyclus van vier jaar uitgevoerd. In de beschreven periode is ongeveer 45 miljoen besteed, aan in totaal 107 projecten. De resultaten hebben bijgedragen aan de kennisen expertiseontwikkeling en aan de wetenschappelijke status van het RIVM. Het programma heeft ook de internationale samenwerking versterkt. Resultaten Van de zeven speerpunten waaronder de projecten zijn gegroepeerd, wordt weergegeven welke inhoudelijke doelen zijn gehaald, zoals nieuwe kennis over gezond ouder worden, het gebruik van nieuwe technologie voor de leefomgeving en de volksgezondheid en de ontwikkeling van nieuwe modellen om gezondheidsrisico's en risico's voor de leefomgeving te beoordelen. Concrete resultaten van SOR-projecten zijn bijvoorbeeld de tekenapp en iSPEX. Met behulp van de tekenapp kun je teken herkennen, leer je hoe je ze moet verwijderen en kun je een gevonden teek melden zodat er onderzoek naar kan worden gedaan. iSPEX is een nieuwe methode om fijnstof te meten met behulp van een iPhone. In beide projecten was de interactie met de burger een belangrijk facet. De wetenschappelijke impact van de publicaties is hoog, gemeten aan de vooraf gestelde doelen. De wetenschappelijke impact is een maat voor de kennisontwikkeling, die wordt gemeten aan de hand van publicaties (242) in wetenschappelijke tijdschriften. Daarnaast is een groot aantal andere producten, zoals rapporten, proefschriften, databases en presentaties op internationale congressen opgeleverd. De maatschappelijke impact geeft aan wat de samenleving aan de onderzoeken heeft en wordt bepaald op basis van het gebruik van de resultaten in vervolgopdrachten, richtlijnen of wetten. strategisch onderzoekThis report describes the results of an evaluation of RIVM's Strategic Research Programme (SOR) for the 2011-2014 period. The SOR budget is aimed at providing RIVM with the required expertise and quality, so that it can perform its tasks effectively both now and in the future, thus contributing to a healthy population and a healthy human environment. SOR projects are carried out in a four-year cycle. During the period surveyed, a total of 107 projects were carried out at a total cost of approx. 45 million euro. The research results contributed to knowledge and expertise development, and helped enhance RIVM's status in the scientific community. The programme also strengthened international collaboration. Results The projects have been categorized under seven 'spearheads'. For each spearhead, the report specifies the substantive aims achieved, such as 'new knowledge on healthy ageing', 'use of new technologies to improve public health and the quality of the human environment', or 'development of new models for assessing health risks and risks affecting the human environment'. Concrete results of SOR projects include the 'Ticks App' and the iSPEX method. With the Ticks App, users can recognize ticks, learn how to remove them, and report ticks for further research. iSPEX is a new method for measuring particulate matter concentrations using an iPhone. Interaction with members of the public was a key aspect of both projects. The scientific impact of RIVM's publications is high when assessed against predefined targets. 'Scientific impact' is a measure for knowledge development, which was quantified based on the number of publications in scientific journals (242 during the period surveyed). In addition, RIVM's activities resulted in numerous other products, including reports, theses, databases and presentations at international conferences. 'Social impact' is a measure of the benefits that RIVM's research yields for society, and was determined based on the extent to which the research results were used in subsequent projects, guidelines or legislation.DG RIV

Sampling from the proteome to the human leukocyte antigen-DR (HLA-DR) ligandome proceeds via high specificity

Comprehensive analysis of the complex nature of the Human Leukocyte Antigen (HLA) class II ligandome is of utmost importance to understand the basis for CD4+ T cell mediated immunity and tolerance. Here, we implemented important improvements in the analysis of the repertoire of HLA-DR-presented peptides, using hybrid mass spectrometry-based peptide fragmentation techniques on a ligandome sample isolated from matured human monocyte-derived dendritic cells (DC). The reported data set constitutes nearly 14 thousand unique high-confident peptides, i.e. the largest single inventory of human DC derived HLA-DR ligands to date. From a technical viewpoint the most prominent finding is that no single peptide fragmentation technique could elucidate the majority of HLA-DR ligands, because of the wide range of physical chemical properties displayed by the HLA-DR ligandome. Our in-depth profiling allowed us to reveal a strikingly poor correlation between the source proteins identified in the HLA class II ligandome and the DC cellular proteome. Important selective sieving from the sampled proteome to the ligandome was evidenced by specificity in the sequences of the core regions both at their N- and C- termini, hence not only reflecting binding motifs but also dominant protease activity associated to the endolysosomal compartments. Moreover, we demonstrate that the HLA-DR ligandome reflects a surface representation of cell-compartments specific for biological events linked to the maturation of monocytes into antigen presenting cells. Our results present new perspectives into the complex nature of the HLA class II system and will aid future immunological studies in characterizing the full breadth of potential CD4+ T cell epitopes relevant in health and disease