Interaction between the Triglyceride Lipase ATGL and the Arf1 Activator GBF1

The Arf1 exchange factor GBF1 (Golgi Brefeldin A resistance factor 1) and its effector COPI are required for delivery of ATGL (adipose triglyceride lipase) to lipid droplets (LDs). Using yeast two hybrid, co-immunoprecipitation in mammalian cells and direct protein binding approaches, we report here that GBF1 and ATGL interact directly and in cells, through multiple contact sites on each protein. The C-terminal region of ATGL interacts with N-terminal domains of GBF1, including the catalytic Sec7 domain, but not with full-length GBF1 or its entire N-terminus. The N-terminal lipase domain of ATGL (called the patatin domain) interacts with two C-terminal domains of GBF1, HDS (Homology downstream of Sec7) 1 and HDS2. These two domains of GBF1 localize to lipid droplets when expressed alone in cells, but not to the Golgi, unlike the full-length GBF1 protein, which localizes to both. We suggest that interaction of GBF1 with ATGL may be involved in the membrane trafficking pathway mediated by GBF1, Arf1 and COPI that contributes to the localization of ATGL to lipid droplets

Study of interaction between an Arf G exchange factor, GBF1, and the lipase ATGL

Les petites protéines G Arf ont besoin d'un facteur d'échange nucléotidique (GEF) afin de passer de leur forme inactive liée au GDP à leur forme active liée au GTP. GBF1 est la GEF pour Arf1 qui assure, notamment, le recrutement du complexe manteau COPI impliqué dans le transport entre le Golgi précoce et le réticulum endoplasmique. Il a été récemment montré que GBF1 est impliqué dans la livraison de l'Adipose TriGlycéride Lipase (ATGL) sur les corps lipidiques (LDs). ATGL est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des triglycérides en diglycérides. Les travaux présentés dans cette thèse ont eu pour objectif d'étudier et de caractériser l'interaction entre GBF1 et la lipase ATGL. Par des expériences de co-immunoprécipitation dans les cellules de mammifère, les domaines des deux protéines impliquées dans l'interaction ont été identifiés. Par des expériences de pulldown utilisant les protéines exprimées chez E. coli, j'ai montré que ces interactions sont directes. Afin d'approfondir l'étude de l'interaction entre GBF1 et ATGL, j'ai construit des outils permettant l'étude biochimique de GBF1 en purifiant plusieurs de ses domaines. J'ai tout d'abord cherché à mettre au point un test d'activité pour GBF1 afin de tester l'influence de protéines partenaires, dont ATGL, sur son activité. Malgré la purification de différents fragments de GBF1 contenant le domaine Sec7, aucun n'a présenté une activité avec Arf1Δ17 en solution. Le domaine N-terminal de la protéine, avec et sans une mutation empêchant une interaction intramoléculaire, ainsi que les domaines HDS1 et HDS2 de GBF1 ont également été purifiésSmall G proteins Arf require assistance from a Guanine nucleotide exchange factor (GEF) in order to switch between GDP- and GTP-bound forms. GBF1 is the Arf1 GEF that mediates COPI coat complex recruitment to early secretory pathway membranes. COPI is a protein that coats vesicles transporting proteins from the cis side of the Golgi complex back to the rough endoplasmic reticulum. GBF1 was recently shown to mediate delivery of Adipose TriGlyceride Lipase (ATGL) to the surface of lipid droplets (LDs). ATGL is an enzyme catalyzing the initial step in triglyceride hydrolysis in LDs. Thus, the aim of this work was to study interactions between GBF1 and ATGL. By co-immunoprecipitation experiments in mammalian cells, the domains of two proteins involved in the interaction have been identified. By pulldown assays using proteins expressed in bacteria, I showed that these interactions are direct. To further study of the GBF1-ATGL interaction, I developed tools for the biochemical study of GBF1, by purifying several of its domains. I first tried to develop a kinetic essay for GBF1 to test the influence of interacting partners, including ATGL, on its activity. Despite the purification of various GBF1 fragments containing the Sec7 domain, none have activity with Arf1Δ17 in solution. The N-terminal domain of the protein, with and without a mutation disrupting an intramolecular interaction, and the HDS1 and HDS2 domains of GBF1 were also purified

Etude de l'intéraction entre le facteur d'échange pour Arf, la protéine GBF1, et la lipase ATGL

Les petites protéines G Arf ont besoin d'un facteur d'échange nucléotidique (GEF) afin de passer de leur forme inactive liée au GDP à leur forme active liée au GTP. GBF1 est la GEF pour Arf1 qui assure, notamment, le recrutement du complexe manteau COPI impliqué dans le transport entre le Golgi précoce et le réticulum endoplasmique. Il a été récemment montré que GBF1 est impliqué dans la livraison de l'Adipose TriGlycéride Lipase (ATGL) sur les corps lipidiques (LDs). ATGL est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des triglycérides en diglycérides. Les travaux présentés dans cette thèse ont eu pour objectif d'étudier et de caractériser l'interaction entre GBF1 et la lipase ATGL. Par des expériences de co-immunoprécipitation dans les cellules de mammifère, les domaines des deux protéines impliquées dans l'interaction ont été identifiés. Par des expériences de pulldown utilisant les protéines exprimées chez E. coli, j'ai montré que ces interactions sont directes. Afin d'approfondir l'étude de l'interaction entre GBF1 et ATGL, j'ai construit des outils permettant l'étude biochimique de GBF1 en purifiant plusieurs de ses domaines. J'ai tout d'abord cherché à mettre au point un test d'activité pour GBF1 afin de tester l'influence de protéines partenaires, dont ATGL, sur son activité. Malgré la purification de différents fragments de GBF1 contenant le domaine Sec7, aucun n'a présenté une activité avec Arf1 17 en solution. Le domaine N-terminal de la protéine, avec et sans une mutation empêchant une interaction intramoléculaire, ainsi que les domaines HDS1 et HDS2 de GBF1 ont également été purifiésSmall G proteins Arf require assistance from a Guanine nucleotide exchange factor (GEF) in order to switch between GDP- and GTP-bound forms. GBF1 is the Arf1 GEF that mediates COPI coat complex recruitment to early secretory pathway membranes. COPI is a protein that coats vesicles transporting proteins from the cis side of the Golgi complex back to the rough endoplasmic reticulum. GBF1 was recently shown to mediate delivery of Adipose TriGlyceride Lipase (ATGL) to the surface of lipid droplets (LDs). ATGL is an enzyme catalyzing the initial step in triglyceride hydrolysis in LDs. Thus, the aim of this work was to study interactions between GBF1 and ATGL. By co-immunoprecipitation experiments in mammalian cells, the domains of two proteins involved in the interaction have been identified. By pulldown assays using proteins expressed in bacteria, I showed that these interactions are direct. To further study of the GBF1-ATGL interaction, I developed tools for the biochemical study of GBF1, by purifying several of its domains. I first tried to develop a kinetic essay for GBF1 to test the influence of interacting partners, including ATGL, on its activity. Despite the purification of various GBF1 fragments containing the Sec7 domain, none have activity with Arf1 17 in solution. The N-terminal domain of the protein, with and without a mutation disrupting an intramolecular interaction, and the HDS1 and HDS2 domains of GBF1 were also purified.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF