Isolamento di nuovi batteri produttori di fitasi e caratterizzazione preliminare delle nuove attività fitasiche

In questa attività di ricerca sono stati isolati due ceppi produttori di fitasi: il ceppo 52, appartenente al genere Aeromonas, isolato da campioni ambientali e Sphingomonas wittichii RW1, isolato in seguito ad analisi computazionale (ricerca in banca dati di geni codificanti putative fitasi, così annotati in base ad omologia di sequenza con le fitasi già caratterizzate). In letteratura non è presente alcun riferimento ad Aeromonas sp. come produttore di fitasi. È stata effettuata una caratterizzazione preliminare dell' attività fitasica del ceppo 52 in termini di optimum di temperatura e optimum di pH, mediante un saggio di quantificazione dell’attività fitasica eseguito sia sugli estratti cellulari che sulle frazioni proteiche ottenute mediante precipitazione con solfato di ammonio e successiva dialisi delle frazioni. L’attività fitasica di S. wittichii RW1 è stata caratterizzata, preliminarmente, mediante un saggio di quantificazione dell’attività fitasica, lavorando sugli estratti cellulari e sulle frazioni proteiche ottenute mediante precipitazione con solfato di ammonio e successiva dialisi delle frazioni. Il gene swphy, codificante la fitasi putativa di S. wittichii RW1 è stato clonato ed espresso in E. coli (BL21DE3). La proteina SWPHY, fusa ad un His-tag N-terminale, è stata purificata e la sua attività fitasica è stata determinata, mediante un saggio di quantificazione dell’attività fitasica, in termini di optimum di temperatura, optimum di pH, analisi della termostabilità, analisi della stabilità a diversi pH, dipendenza dell’attività dalla presenza di ioni minerali quali calcio, magnesio, manganese, litio, zinco, ferro, resistenza alla proteolisi

A novel β-propeller phytase from the dioxin-degrading bacterium Sphingomonas wittichii RW-1

β-propeller phytase-like sequences (BPP-like sequences) are widespread in the microbial world and have been found in the sequenced genomes of aquatic, soil, and plant bacteria. Exploring NCBI microbial genome database for putative genes encoding phytase, a BPP-like sequence from Sphingomonas wittichii RW-1 (Sequence ID: CP000699.1), known for its capacity of degrading polychlorinated dibenzo-p-dioxins and dibenzofurans, was recognized. The putative phytase gene (phySw) was amplified with specific primers, cloned, and overexpressed in Escherichia coli and the catalytic properties of the recombinant PhySw protein were analyzed. The results show that phySw encodes an enzyme with the properties of β-propeller phytases: it requires the presence of Ca2+ ions, it is optimally active at 55 °C, and it has a pH optimum of 6.0 with good activity in the range 6.0–8.0. Furthermore, the enzyme exhibits a good thermostability, recovering 68% of its original activity after treatment at 80 °C for 10 min, and shows a good substrate specificity for phytic acid. These properties render this enzyme a candidate as an animal feed additive (e.g., for aquaculture industry). The isolation of phytases from a hydrocarbon-utilizing microorganism also opens new scenarios for their possible application in combating oil pollution