HIF-Overexpression and Pro-Inflammatory Priming in Human Mesenchymal Stromal Cells Improves the Healing Properties of Extracellular Vesicles in Experimental Crohn’s Disease

Extracellular vesicles (EVs) derived from mesenchymal stromal cells (MSCs) have therapeutic potential in the treatment of several immune disorders, including ulcerative colitis, owing to their regenerative and immunosuppressive properties. We recently showed that MSCs engineered to overexpress hypoxia-inducible factor 1-alpha and telomerase (MSC-T-HIF) and conditioned with pro-inflammatory stimuli release EVs (EVMSC-T-HIFC) with potent immunomodulatory activity. We tested the efficacy of EVMSC-T-HIFC to repolarize M1 macrophages (Mφ1) to M2-like macrophages (Mφ2-like) by analyzing surface markers and cytokines and performing functional assays in co-culture, including efferocytosis and T-cell proliferation. We also studied the capacity of EVMSC-T-HIFC to dampen the inflammatory response of activated endothelium and modulate fibrosis. Finally, we tested the therapeutic capacity of EVMSC-T-HIFC in an acute colitis model. EVMSC-T-HIFc induced the repolarization of monocytes from Mφ1 to an Mφ2-like phenotype, which was accompanied by reduced inflammatory cytokine release. EVMSC-T-HIFc-treated Mφ1 had similar effects of immunosuppression on activated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) as Mφ2, and reduced the adhesion of PBMCs to activated endothelium. EVMSC-T-HIFc also prevented myofibroblast differentiation of TGF-β-treated fibroblasts. Finally, administration of EVMSC-T-HIFc promoted healing in a TNBS-induced mouse colitis model in terms of preserving colon length and intestinal mucosa architecture and altering the ratio of Mφ1/ Mφ2 infiltration. In conclusion, EVMSC-T-HIFC have effective anti-inflammatory properties, making them potential therapeutic agents in cell free-based therapies for the treatment of Crohn’s disease and likely other immune-mediated inflammatory diseases

Terapia basada en vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales para el tratamiento de la toxicidad inducida por la doxorrubicina en las distintas poblaciones celulares del corazón

[ES] La mejora en los tratamientos y la aparición de métodos más eficaces de diagnóstico temprano han conducido a una mayor supervivencia de los pacientes con cáncer. Sin embargo, esto ha venido acompañado de un incremento en el número de pacientes que sufren efectos secundarios como consecuencia del tratamiento anti-cancerígeno. Las antraciclinas, entre las que destaca la doxorrubicina, son uno de los tratamientos quimioterapéuticos más empleados, tanto solos, como en combinación con otros fármacos. Sin embargo, su uso está relacionado con varios efectos secundarios, entre los cuales la cardiotoxicidad se revela como el más severo. Actualmente existen algunas estrategias terapéuticas genéricas que permiten disminuir las consecuencias de la cardiotoxicidad inducida por antraciclinas, pero la efectividad es baja y no es posible suministrarla a todos los pacientes. Cabe destacar que no es posible diagnosticar la aparición de la insuficiencia cardiaca previamente al daño tisular, lo que unido a que todavía no se conocen exactamente los mecanismos por los que la doxorrubicina genera cardiotoxicidad, dificulta significativamente el diseño de terapias efectivas. Dentro de los estudios de cardiotoxicidad realizados con doxorrubicina, su efecto sobre los cardiomiocitos es el fenómeno más estudiado, mientras que existen pocos trabajos que estudien el corazón en su conjunto o se centren en el resto de los tipos celulares presentes en el corazón (fibroblastos y células endoteliales). Por ello, uno de los objetivos de este trabajo consiste en determinar el efecto de la doxorrubicina sobre los tres principales tipos celulares del corazón, es decir, cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos cardíacos. Por otro lado, la escasa efectividad de los tratamientos existentes anteriormente mencionada hace necesaria la búsqueda de tratamientos efectivos que permitan reducir las consecuencias del daño sobre el corazón. La terapia con células madre mesenquimales (MSC) ha mostrado efectos beneficiosos en múltiples modelos animales de enfermedades cardiovasculares y entre ellos en la cardiotoxicidad mediada por antraciclinas. Cabe destacar que diferentes estudios han indicado que el efecto regenerador tras un evento isquémico mediado por estas células se debe fundamentalmente a factores paracrinos y más concretamente a las vesículas extracelulares. En este sentido existe poca literatura respecto al mecanismo protector de las MSC en el ámbito de la cardiotoxicidad inducida por doxorrubicina, por lo que otro de los objetivos de este trabajo consiste en determinar el efecto del medio condicionado y de las vesículas extracelulares obtenidas a partir de cultivos de MSC sobre la cardiotoxicidad inducida por la doxorrubicina. Para realizar este estudio se emplearán cultivos celulares de cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos cardíacos sobre las cuales se estudiarán los efectos del tratamiento con doxorubicina en cuanto a generación de estrés oxidativo, disminución de viabilidad celular y/o alteración de la capacidad funcional. En definitiva, este trabajo servirá para profundizar en los mecanismos de toxicidad de la doxorrubicina sobre las diferentes poblaciones celulares del corazón y avanzar en el diseño de una estrategia terapéutica frente a dicho daño mediante el uso de la fracción secretora de las MSC.[EN] The improvement in treatments and the emergence of more effective methods of early diagnosis have led to a greater survival of cancer patients. Nevertheless, this has also led to an increase in the number of patients suffering side effects of anti-cancer treatments. Anthracyclines, specially doxorubicin, are one of the most used chemotherapeutic treatments, either alone or in combination with other drugs. However, its use is related to several side effects, among which cardiotoxicity is the most severe. Currently there are some generic therapeutic strategies that allow to reduce the consequences of cardiotoxicity induced by anthracyclines, but the effectiveness is low and it is not possible to provide it to all patients. It should be noted that it isn¿t possible to diagnose the appearance of heart failure prior to tissue damage, which, together with the fact that the mechanisms by which doxorubicin generates cardiotoxicity remain unknown, increases significantly the difficulty of the design of effective therapies. Among the studies of cardiotoxicity performed with doxorubicin, its effect on cardiomyocytes is the most studied phenomenon, while there are few studies that investigate the heart as a whole or focus on the rest of the cell types present in the heart (fibroblasts and endothelial cells). Therefore, one of the objectives of this work is to determine the effect of doxorubicin on the three major cell types of the heart, namely, cardiomyocytes, endothelial cells and cardiac fibroblasts. On the other hand, the scarce effectiveness of existing treatments mentioned above, makes it necessary to search for effective treatments that reduce the damage of the heart. Mesenchymal stem cell therapy (MSC) has shown beneficial effects in multiple animal models of cardiovascular diseases and among them in anthracycline-mediated cardiotoxicity. It should be noted that different studies have indicated that the regenerative effect after an ischemic event mediated by these cells is mainly due to paracrine factors and more specifically to the extracellular vesicles. There is little literature regarding the protective mechanism of MSCs in the field of cardiotoxicity induced by doxorubicin, so another objective of this work is to determine the effect of conditioned medium and extracellular vesicles obtained from MSC cultures on the cardiotoxicity induced by doxorubicin. To carry out this study cell cultures of cardiomyocytes, endothelial cells and cardiac fibroblasts will be used, on which the effects of doxorubicin treatment will be studied in terms of generation of oxidative stress, decreased cell viability and/or impaired functional capacity. In short, this work will serve to deepen the mechanisms of toxicity of doxorubicin on different cell populations of the heart and to advance in the design of a therapeutic strategy against such damage using the secretory fraction of MSCs.Amaro Prellezo, E. (2019). Terapia basada en vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales para el tratamiento de la toxicidad inducida por la doxorrubicina en las distintas poblaciones celulares del corazón. http://hdl.handle.net/10251/124560TFG

Las vesículas extracelulares derivadas de células mesenquimales estromales de pulpa dental como producto terapéutico frente a la respuesta inmune que se desencadena tras el infarto agudo de miocardio

[ES] El infarto agudo de miocardio (IAM) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los países desarrollados. A lo largo de los últimos años se ha visto que la respuesta inflamatoria que ocurre tras desencadenarse el IAM es muy importante en el desarrollo clínico de esta patología. Si se produce una respuesta inflamatoria exacerbada aumenta el riesgo de remodelado cardiaco adverso y fallo cardiaco, pero el hecho de que no se desencadene la respuesta inflamatoria también tiene consecuencias negativas. Debido a la importancia de la respuesta inflamatoria en el IAM, recientemente se han intentado desarrollar terapias dirigidas frente componentes celulares o moleculares que participan en esta respuesta. Dentro de estas terapias, la terapia celular con células mesenquimales estromales (MSC) se ha postulado como un buen candidato. Las MSC se caracterizan fundamentalmente por su capacidad inmunomoduladora, lo que ha conducido a su empleo como agentes terapéuticos en diferentes enfermedades que cursan con procesos inflamatorios. Sin embargo, a lo largo de los últimos años, numerosos estudios han mostrado que el efecto terapéutico de las MSC está mediado fundamentalmente por las vesículas extracelulares (EVs) que liberan. Estas EVs recapitulan los efectos terapéuticos de las células de origen, por lo que también presentan efectos inmunomoduladores. El empleo de las EVs de MSC como agentes terapéuticos presenta ventajas respecto al uso de las MSC como, por ejemplo, una mayor bioseguridad. No obstante, el uso clínico de las EVs todavía tiene que hacer frente a retos como la obtención de grandes cantidades de EVs que constituyan un producto clínico estable y homogéneo. En este trabajo se ha querido evaluar, por un lado, si las EVs obtenidas de diferentes biopsias de la misma fuente tisular de MSC pueden constituir un producto biológico homogéneo que presente las mismas características y funcionalidad. Por otro lado, se ha evaluado si estas EVs se pueden emplear como agente terapéutico frente a la respuesta inflamatoria que se desencadena tras el IAM. Para ello se ha estudiado el efecto inmunomodulador de las EVs sobre células del sistema inmune, fundamentalmente macrófagos, in vitro y en un modelo in vivo de IAM en ratas. Los resultados mostraron que las EVs favorecen la diferenciación de los macrófagos M1 proinflamatorios hacia un fenotipo similar al M2, aumentando la expresión de marcadores M2 y reduciendo la secreción de citocinas proinflamatorias. Además, las EVs promovieron la activación de neutrófilos in vitro y la reducción de su estrés oxidativo. La administración de EVs en ratas sometidas a IAM amortiguó la caída de la función cardiaca y limitó la extensión de la zona infartada a los 7 y 21 días postinfarto. Las EVs también redujeron el número de macrófagos y neutrófilos proinflamatorios dentro de la zona infartada, favoreciendo la resolución de la inflamación. En conclusión, las EVs empleadas en este trabajo han demostrado ser un producto biológico estable con independencia de la biopsia de la que proceden, y han demostrado ser capaces de ejercer respuestas pro-resolutivas eficaces en un modelo de isquemia miocárdica, lo que las convierte en potenciales agentes terapéuticos para tratar la inflamación en el IAM.[CA] L'infart agut de miocardi (IAM) és una de les principals causes de morbiditat i mortalitat als països desenvolupats. Al llarg dels darrers anys s'ha vist que la resposta inflamatòria que passa després de desencadenar-se l'IAM és molt important en el desenvolupament clínic d'aquesta patologia. Si es produeix una resposta inflamatòria exacerbada augmenta el risc de remodelat cardíac advers i fallada cardíaca, però el fet que no es desencadeni la resposta inflamatòria també té conseqüències negatives. A causa de la importància de la resposta inflamatòria a l'IAM, recentment s'han intentat desenvolupar teràpies dirigides davant de components cel·lulars o moleculars que participen en aquesta resposta. Dins aquestes teràpies, la teràpia cel·lular amb cèl·lules mesenquimals estromals (MSC) s'ha postulat com un bon candidat. Les MSC es caracteritzen fonamentalment per la seva capacitat immunomoduladora, cosa que ha conduït a la seva ocupació com a agents terapèutics en diferents malalties que cursen amb processos inflamatoris. Tot i això, al llarg dels últims anys, nombrosos estudis han mostrat que l'efecte terapèutic de les MSC està intervingut fonamentalment per les vesícules extracel·lulars (EVs) que alliberen. Aquestes EVs recapitulen els efectes terapèutics de les cèl·lules dorigen, per la qual cosa també presenten efectes immunomoduladors. L'ús de les EVs de MSC com a agents terapèutics presenta avantatges respecte a l'ús de les MSC com, per exemple, una bioseguretat més gran. Tot i això, l'ús clínic de les EVs encara ha de fer front a reptes com l'obtenció de grans quantitats d'EVs que constitueixin un producte clínic estable i homogeni. En aquest treball s'ha volgut avaluar, d'una banda, si les EV obtingudes de diferents biòpsies de la mateixa font tissular de MSC poden constituir un producte biològic homogeni que presenti les mateixes característiques i funcionalitat. D'altra banda, s'ha avaluat si aquestes EVs es poden fer servir com a agent terapèutic davant de la resposta inflamatòria que es desencadena després de l'IAM. Per això s'ha estudiat l'efecte immunomodulador de les EV sobre cèl·lules del sistema immune, fonamentalment macròfags, in vitro i en un model in vivo d'IAM en rates. Els resultats van mostrar que les EVs afavoreixen la diferenciació dels macròfags M1 proinflamatoris cap a un fenotip similar al M2, augmentant l'expressió de marcadors M2 i reduint la secreció de citocines proinflamatòries. A més, les VE van promoure l'activació de neutròfils in vitro i la reducció del seu estrès oxidatiu. L'administració d'EVs en rates sotmeses a IAM va esmorteir la caiguda de la funció cardíaca i va limitar l'extensió de la zona infartada als 7 i 21 dies postinfart. Les EVs també van reduir el nombre de macròfags i neutròfils proinflamatoris dins de la zona infartada, afavorint la resolució de la inflamació. En conclusió, les EVs emprades en aquest treball han demostrat ser un producte biològic estable amb independència de la biòpsia de què procedeixen, i han demostrat ser capaços d'exercir respostes pro-resolutives eficaces en un model d'isquèmia miocàrdica, cosa que les converteix en agents terapèutics potencials per tractar la inflamació a l'IAM.[EN] Acute myocardial infarction (AMI) is one of the main causes of morbidity and mortality in developed countries. Over the last few years, it has been shown that the inflammatory response that occurs after AMI is triggered is very important in the clinical development of this pathology. If an exacerbated inflammatory response occurs, the risk of adverse cardiac remodeling and heart failure increases, but failure to trigger the inflammatory response also has negative consequences. Because of the importance of the inflammatory response in AMI, recent attempts have been made to develop therapies that target cellular or molecular components involved in this response. Within these therapies, cell therapy with mesenchymal stromal cells (MSC) has been postulated as a good candidate. MSC are mainly characterized by their immunomodulatory capacity, which has led to their use as therapeutic agents in different diseases involving inflammatory processes. However, in recent years, numerous studies have shown that the therapeutic effect of MSCs is mainly mediated by the extracellular vesicles (EVs) they release. These EVs recapitulate the therapeutic effects of the cells of origin and therefore also have immunomodulatory effects. The use of MSC-EVs as therapeutic agents has advantages over the use of MSC, such as increased biosafety. However, the clinical use of EVs still faces challenges such as obtaining large quantities of EVs that constitute a stable and homogeneous clinical product. The aim of this study was to evaluate, on the one hand, whether EVs obtained from different biopsies of the same MSC tissue source can constitute a homogeneous biological product with the same characteristics and functionality. On the other hand, we have evaluated whether these EVs can be used as a therapeutic agent against the inflammatory response triggered after AMI. To this end, the immunomodulatory effect of EVs on immune system cells, mainly macrophages, was studied in vitro and in an in vivo model of AMI in rats. The results showed that EVs favored the differentiation of proinflammatory M1 macrophages towards an M2-like phenotype, increasing the expression of M2 markers and reducing the secretion of proinflammatory cytokines. In addition, EVs promoted the activation of neutrophils in vitro and the reduction of their oxidative stress. The administration of EVs in rats subjected to AMI blunted the decline in cardiac function and limited the extent of the infarct zone at 7- and 21-days post-infarction. EVs also reduced the number of proinflammatory macrophages and neutrophils within the infarct zone, favoring the resolution of inflammation. In conclusion, the EVs used in this work have been shown to be a stable biological product regardless of the biopsy from which they are derived and have been shown to be able to exert effective pro-resolving responses in a model of myocardial ischemia, making them potential therapeutic agents to treat inflammation in AMI.Amaro Prellezo, E. (2024). Las vesículas extracelulares derivadas de células mesenquimales estromales de pulpa dental como producto terapéutico frente a la respuesta inmune que se desencadena tras el infarto agudo de miocardio [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/20297

Biofilm formation in <em>Hafnia alvei</em> HUMV-5920, a human isolate

Hafnia alvei is a Gram-negative, rodshaped, facultative anaerobic bacterium of the family Enterobacteriaceae that has been isolated from various mammals, fish, insects and birds. In humans, case reports of Hafnia-associated enteric infections have been chiefly reported in Spain. Although H. alvei shares some virulence mechanisms with other Gram-negative enteropathogens little is known about the factors that contribute to its pathogenesis or virulence factors and regulatory circuits that may enhance the establishment and survival of H. alvei in the environment. The goal of the present study was to analyze the capacity of a H. alvei clinical isolate (strain HUMV-5920) to form biofilms. Biofilm formation by this strain increases during growth at 28 °C compared to 37 °C. Investigation of multicellular behavior by confocal microscopy, crystal violet and calcofluor staining in this strain showed biofilm formation associated with the production of cellulose. Importantly, several genes related to cellulose production including bcsABZC and yhjQ are present in the H. alvei HUMV-5920 chromosome. The ability of H. alvei to adhere to abiotic surfaces and to form biofilms likely contributes to its persistence in the hospital environment or food processing environments, increasing the probability of causing infections. Therefore, a better understanding of the adherence properties of this species will provide greater insights into the diseases it causes

Topical Administration of a Marine Oil Rich in Pro-Resolving Lipid Mediators Accelerates Wound Healing in Diabetic db/db Mice through Angiogenesis and Macrophage Polarization

Impaired wound healing in patients with type 2 diabetes (DM2) is characterized by chronic inflammation, which delays wound closure. Specialized pro-resolving lipid mediators (SPMs) are bioactive molecules produced from essential polyunsaturated fatty acids (PUFAs), principally omega-3 docosahexaenoic acid (DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA). SPMs are potent regulators of inflammation and have been used to suppress chronic inflammation in peripheral artery disease, non-alcoholic fatty liver disease, and central nervous system syndromes. LIPINOVA&reg; is a commercially available safe-grade nutritional supplement made from a fractionated marine lipid concentrate derived from anchovy and sardine oil that is rich in SPMs and EPA, as well as DHA precursors. Here, we assessed the effect of LIPINOVA&reg; in wound dressing applications. LIPINOVA&reg; showed biocompatibility with keratinocytes and fibroblasts, reduced the abundance of pro-inflammatory macrophages (M&phi;1), and promoted in vitro wound closure. Daily application of the marine oil to open wounds made by punch biopsy in db/db mice promoted wound closure by accelerating the resolution of inflammation, inducing neoangiogenesis and M&phi;1/M&phi;2 macrophage polarization. In conclusion, LIPINOVA&reg; displays pro-resolutive properties and could be exploited as a therapeutic agent for the treatment of diabetic ulcers