Humán alkalikus foszfatázt termelő transzgenetikus nyulak előállítása lentivirus géntranszferrel = Creating human alkaline phosphatase producing transgenic rabbits by lentiviral gene transfer

SIV lentivírus vektorral GFP-t expresszáló transzgenikus alapító nyulakat állítottunk elő. Legjobb tudásunk szerint lentivírussal elsőként sikerült transzgenikus nyulat előállítanunk világszerte. Mivel azonban az alapító nyulak különböző mértékben mozaikosak, élő zöld utódnyúl nem született. Emiatt az előre nem látható fajspecifikus különbség miatt, a pályázatban eredetileg tervezett emlőszövetspecifikus promóter - humán szöveti nemspecifikus foszfatáz transzgenikus nyulak előállítására lentivírus transzgenezissel nem került sor. Az előmag mikroinjektálással korábban előállított transzgenikus nyulak tejéből, három különböző módon próbáltunk tisztított rekombináns humán szöveti nemspecifikus foszfatáz fehérjét izolálni. A tisztított rekombináns fehérje biológiai hatásának igazolása szepszis egérmodellen folyamatban van. | GFP expressing transgenic rabbits were created with SIV lentiviral vector. To our knowledge those are the first lentiviral transgenic rabbits worldwide. Since the founder rabbits were expressing the transgene in mosaic pattern to different extent, alive green rabbit did not born from any of the founders. Due to this species specific difference in the efficiency of lentiviral transgenesis, we did not try to establish lentiviral transgenic rabbits with the planned mammary gland specific promoter - human tissue non-specific alkaline phosphatase lentiviral construct. From the milk of the human tissue non-specific alkaline phosphatase expressing transgenic rabbits, which were created by pronuclear microinjection we tried to isolate the recombinant protein on three different ways. Evaluation of the biological activity of the purified recombinant human tissue non-specific alkaline phosphatase is in progress

Kiméria-technikák kidolgozása klónozás, hímesítés és genetikai manipulációk céljára = Elaboration of chimera techniques for cloning, masculinisation and gene manipulations

Célunk kiméra-előállítási technikák kidolgozása volt egér, nyúl és szarvasmarha embriókon. Az egér ES-sejtvonalak kiméra alkotó képességét leginkább az euploid sejtek aránya befolyásolta. FISH technikát alkalmazva kimutattuk az X- és Y-kromoszómákat euploid sejtekben, illetve hiányukat az X0 kariotípusú sejtekben. Nyúl 8-sejtes morulák egyetlen sejtjének felhasználásával négy termékeny kiméra utód, két XX/XX nőstény, egy XY/XY és egy XX/XY hím született. Az egyik nőstény és az XY/XY hím germinális kiméra volt. A nyúl ES-like sejt-kolóniákat 6-7 passzázsig fenntartottuk és kidolgoztuk a sejtjeik felhasználásához szükséges kiméra technikát. Sikerült kidolgozni a tetraploid nyúl embrió előállításához szükséges paramétereket. Az A-single spermatogóniumok sejtszuszpenzióban nem azonosíthatók és kis hányadban vannak jelen, így alkalmazásuk kiméra embriók előállítására további kutatást igényel. Hatékony in vitro szarvasmarha-embrió-tenyésztési rendszert dolgoztunk ki és sikerült létrehoznunk tetraploid szarvasmarha embriókat. A beültetett kontroll embriókból egy borjút született. 2005-ben a szex-determinációt vizsgáltuk egér kimérákon. Igazoltuk, hogy egyetlen XY blasztoméra bevitele is elégséges lehet az XX embriók nemének átfordításához és, hogy tetraploid gazda embrióval aggregáltatva egy nyolcsejtes embrió egyetlen blasztomerjéből is életképes utód születhet. Az általunk kidolgozott módszerrel előre meghatározott nemű, identikus hármas és kettes ikreket hoztunk létre. | Our goal was the elaboration of chimera techniques in mouse, rabbit and cattle embryos. Chimera producing ability of mouse ES-cell lines was most influenced by the proportion of euploid cells. We demonstrated the presence of X- and Y-chromosomes in euploid cells and their absence in X0 cells. Using individual blastomeres of 8-cell rabbit morulae four fertile chimera offspring, two XX/XX females, one XY/XY and one XX/XY male were born. One female and the XY/XY male were germinal chimeras. Rabbit ES-like colonies were sustained for 6-7 passages and we elaborated the chimera technique for using their cells. Most of the rabbit ES-chimera embryos did well develop and we elaborated the techniques of producing tetraploid rabbit embryos. A-single spermatogonia cannot be identified in suspension and their number is low, therefore their application in chimera making requires further research. We elaborated an effective bovine IVF system and produced tetraploid bovine embryos. From the transferred control embryos one calf was born. In 2005 we investigated the sex-determination in mouse chimeras in this year. We stated that a single introduced XY blastomere is capable to turn the sex of the XX embryos, and we got viable offspring from single blastomeres of 8-cell embryos by aggregating them with tetraploid host embryos. We produced an identical triplet and twins of pre-determined sex by the method elaborated by us

Fejlődés specifikus gének expressziós mintázatának összehasonlítása pluripotens nyúl embrionális és epiblaszt őssejtekben. = Comparison of developmental stage specific gene expression patterns in pluripotent rabbit embryonic and epiblast derived stem cell lines .

Transzgénikus nyulak kiváló modell állatként szolgálnak az öröklött humán betegségek tanulmányozására. Jelenleg nem áll rendelkezésre olyan pluripotens embrionális őssejt vonal, ami lehetővé tenné célzott genetikai módosítások végrehajtását nyúlban. Ivarsejt kimérákat mind a mai napig nem sikerült előállítani ezek felhasználásával. A Nanog és az Oct4 transzkripciós faktorok a legfontosabb gének, amik elősegítik a pluripotencia megtartását egér és humán őssejtekben, azonban nyúl esetében nagyon keveset tudtunk ezen gének expressziójáról. Sikerült feltérképeznünk a nyúl őssejt specifikus markerek expresszióját a nyúl embriók fejlődése során, valamint embrionális és epiblaszt őssejtekben. Az őssejtek passzálásának előrehaladtával az epiblaszt specifikus Oct4, és Nanog szint csökkenni kezdett, a trofoblaszt (Cdx2) és hipoblaszt (Gata4, Gata6) sejtekre jellemző markerek expressziója viszont továbbra is kimutatható maradt. Ezekben sejttenyészetekben az őssejt kolóniák nagy része differenciálódni kezdett, valószínűleg a sejttenyészetben megtalálható hipoblaszt és trofoblaszt eredetű sejtekből származó faktorok hatásának eredményeként. A munka folytatásaként szeretnénk megismerni a nyúl Ins, Wnt, FGF4 és LIF jelátvitelben résztvevő elemeket, kiegészítve a regulációban fontos szerepet játszó őssejt specifikus nyúl mikroRNS-ek szerepének megismerésével. Azt reméljük, hogy ezen jelátviteli rendszerek megismerése segíthet valóban pluripotens nyúl ES sejtvonalak létrehozásában. | Laboratory rabbits have long been used in biomedical research. Recently, they have been used as experimental models for human diseases. Rabbit ES cells would be invaluable for the study of testing stem cell therapies for human applications. Although many attempts have been made to derive real pluripotent ES cell lines from rabbits, none has been successful. We analyzed the expression pattern of embryonic stem cell specific markers in rabbit embryos and epiblast cells. The expression pattern of Oct4, Nanog transcriptions factors during the rabbit embryonic development was not known. Epiblast specific Oct4 and Nanog, trophoblast specific Cdx2 and hypoblast specific Gata4 and Gata6 were examined in blastocysts, attached embryos and epiblast like cells. The Oct4 and Nanog in rabbit ES-like cells expressed at high level reflecting their pluripotent state, but reduced passage by passage. We could recognize Cdx2 expression which might be related to cells derived from remaining trophoblast cells. We could also detect low level of Gata4 and Gata6 expressing colonies correlated with some differentiated and hypoblast derived cells. After few passages the most of the epiblast derived colonies begin to differentiate, most likely as a result of the effect of remaining hypoblast and trophoblast cells derived factors. As a continuation of our work, we want to investigate the rabbit Ins, Wnt, FGF4 and LIF signaling elements in addition with stem cells specific rabbit microRNAs

EXAMINATION OF THE GERM CELL CHIMERA FORMING POTENTIAL OF MOUSE EMBRYONIC STEM CELLS

The aim of this study was to examine the factors, which influence the chimeraforming potential of mouse embryonic stem cells (ES cells). In our work, we examinethe chimera producing ability of R1 and R1/E mouse ES cell lines. We found that thepassage number affects chimera-forming capability of the ES cells. With theincreasing of the passage number, it could be getting less chimera animal, and onlythe R1/E ES cell line derived cells could contribute to the germ cells. At first, wecompared the marker of pluripotency using immunostaining and RT PCR, but wecould not find any difference between the R1 and R1/E cell in this way. Atchromosome analysis, we found, that the number of aneuploid cells, in R1 ES cellline, dramatically increased after 10 passages. We thought that the reason is thatduring the cell division Y chromosome could not arrange correctly between the twonewly derived progeny cells. To prove our conception, we made X and YchromosomeFISH analyses. We found, that the aneuploid R1 and R1/E ES cellscontain only one X and one Y chromosome, so not the loss of Y chromosome causethe problem at the germ cell formation. At last, we made the karyotypeanalysis of R1 and R1/E ES cells at different passages. The karyotype analysisdemonstrated that in the case of R1 ES cell line, the 41 and 42-chromosomecontaining cells hold trisomy. With the increasing of the passages number, thenumber of trisomy containing aneuploid cells increased. The aneuploid ES cells cancontribute to the different tissuses of chimera animals, but cannot form viable germcells

GENETIC POLYMORPHISM AT THE K-CASEIN LOCUS IN A DAIRY HERD OF ROMANIAN SPOTTED AND BROWN OF MARAMURES BREEDS

Caseins are a family of milk proteins that exist in several molecular forms and arethe main proteins present in the bovine milk. Genetic variation of these proteins hasbeen associated with the quality and quantity of cheese derived from milk.This study was focused on possibilities to evaluate the frequency of the K-casein Ballele in dairy herds from the Research and Development Station for Bovine RaisingArad in order to have breeding programs that target an increase in the frequency ofthe B allele in the dairy cattle population.In order to differentiate the favorable genotype for superior composition and highercheese yield, we used simple DNA extraction method from fresh blood andtechniques based on DNA analysis, which include polymerase chain reaction andrestriction fragment length polymorphisms (PCR-RFLP) methods. Employing thesetechniques we were able to determine the k-casein genotype of all individuals in agiven population under selection, regardless of sex, age or physiological stage.As a result, it is now possible to include information on milk protein genotypes intomarker assisted selection programs and consequently improve response to selection

Preimplantation Genetic Diagnosis in cattle: A review

Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) is reviewed and novel fields where it may be applied are investigated. Technical advances of PGD in cattle embryos have already enabled its integration as a part of the MOET (Multiple Ovulation Embryo Transfer) breeding system. PGD for well-defined selection targets can enhance cattle breeding and embryo trade. It allows embryo selection according to their sex, and it may be used to breed special cow lines, or top bulls, by selecting embryos for valuable production traits using Marker Assisted Selection (MAS). A good allelic profile and/or the insertion of a transgene can be detected by PGD. This review article presents the technical requirements for PGD, and shows that this biotechnological method has great economic potential

Glomerulosclerosis in transgenic rabbits with ubiquitous Venus protein expression

Focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) is a potential cause of nephrotic syndrome both in humans and pet mammals. Glomerulopathy was reported earlier in green fluorescent protein (GFP) transgenic (TG) mice, but glomerulosclerosis has not been examined in GFP TG rabbits so far. In the present study, the potential manifestation of FSGS was investigated in both Venus TG rabbits generated by Sleeping Beauty (SB) transposition and age-matched control New Zealand White (NZW) rabbits. Venus protein fluorescence was detected by confocal microscopy and quantified by microplate reader. Urinalysis, haematology, serum biochemistry and renal histology were performed to assess the signs of FSGS. Higher levels of Venus fluorescence were determined in renal cortex samples than in the myocardium by both methods. Urinalysis revealed proteinuria in Venus heterozygote TG bucks, while Venus homozygote TG bucks developed microscopic haematuria. Supporting the urinalysis data, the histological findings of FSGS (glomerulomegaly and sclerotic glomeruli) were observed in renal cortex sections of Venus TG rabbits. Taken together, Venus TG bucks were diagnosed with FSGS; thus, this type of glomerulopathy could be a common disease in TG animals overexpressing GFP

Klímaváltozás hatása a házi tyúk reproduktív rendszerére

A klímaváltozás hatására megemelkedett középhőmérséklethez, illetve a szélsőséges nyarakhoz való alkalmazkodás képessége nélkülözhetetlen háziállataink számára. A fenntartható mezőgazdaság egyik fontos eleme, hogy háziállataink képesek legyenek tolerálni a megemelkedett környezeti hőmérsékletet. A megtermékenyített erdélyi kopasznyakú tyúktojásokat a Nemzeti Biodiverzitás- és Génmegőrzési Központ - Haszonállat-génmegőrzési Intézetből (NBGK-HGI) gyűjtöttük. A megtermékenyített tojásokat kezelések szerint három csoportba sorolt házi tyúkoktól gyűjtöttük. Az első, a (C) kontroll csoport, amik normál körülmények között nőttek fel. A második csoportot (heat treatmant and heat stressed – HTHS) 2 napos korban 12 órán keresztül hőkondícionáltuk (38,5 oC) majd 23 hetes korukban hőstresszeltük (30 oC) 12 héten át. A harmadik csoportot (heat stressed – HS) csak hőstresszeltük 30 oC-on való tartással szintén 12 hétig. Kutatásunk során elsőként szaporodási paramétereket és az embriófejlődés sikerességét vizsgáltuk. A biotechnológia területén régóta várt cél a madár embriókból izolált őssejtvonalak létrehozása. Csoportunk 26 primordiális csírasejt (Primordial germ cell – PGC) vonalat hozott létre, amelyek hőkezelt és nem kezelt tyúkok tojásában fejlődött embriókból származnak. Ezen PGC vonalak használatával csoportunk megvizsgálhatja a hőstressz hatását a hőkezelt csirkék utód generációjában. Ezekben a primordiális ivarsejt tenyészetekben a mikroRNS-ek (miRNS) expressziós szintjének változása volt kimutatható. A miRNS-ek közül a miR-138-nak tulajdonítanak nagyobb szerepet. A PGC minták vizsgálata során azt találtuk, hogy a miR-138 expresszió a HTHS csoportból származó PGC-kben magasabb volt, mint a kontroll csoportban. Tehát a létrehozott PGC vonalakkal lehetőségünk van jellemezni a hőkezelés és a hőstressz hatását házi tyúkban