Resistance Evolution Against Antimicrobial Peptides in Staphylococcus aureus Alters Pharmacodynamics Beyond the MIC

Antimicrobial peptides (AMPs) have been proposed as a promising class of new antimicrobials partly because they are less susceptible to bacterial resistance evolution. This is possibly caused by their mode of action but also by their pharmacodynamic characteristics, which differ significantly from conventional antibiotics. Although pharmacodynamics of antibiotic resistant strains have been studied, such data are lacking for AMP resistant strains. Here, we investigated if the pharmacodynamics of the Gram-positive human pathogen Staphylococcous aureus evolve under antimicrobial peptide selection. Interestingly, the Hill coefficient (kappa κ) evolves together with the minimum inhibition concentration (MIC). Except for one genotype, strains harboring mutations in menF and atl, all mutants had higher kappa than the non-selected sensitive controls. Higher κ results in steeper pharmacodynamic curve and, importantly, in a narrower mutant selection window. S. aureus selected for resistance to melittin displayed cross resistant against pexiganan and had as steep pharmacodynamic curves (high κ) as pexiganan-selected lines. By contrast, the pexiganan-sensitive tenecin-selected lines displayed lower κ. Taken together, our data demonstrate that pharmacodynamic parameters are not fixed traits of particular drug/strain interactions but actually evolve under drug treatment. The contribution of factors such as κ and the maximum and minimum growth rates on the dynamics and probability of resistance evolution are open questions that require urgent attention

Antimikrobielle Peptidresistenz: Infektionsdynamik, Kreuzempfindlichkeit gegenüber Insektenimmuneffektoren und Entwicklung der Pharmakodynamik

Host defence and parasite pathogenicity interactions determine infection outcomes. Antimicrobial peptides (AMPs) are conserved components of immune defences of multicellular organisms. In this thesis, the fitness costs of the evolution of resistance toward the host’s own AMPs were investigated. In chapter 1, the experiment focused on the in vivo fitness cost of evolving AMP resistance. The mealworm beetle, Tenebrio molitor, was used as a host. The opportunistic pathogen Staphylococcus aureus selected against one or two of the beetle abundant AMPs was injected into T. molitor. The AMPresistant parasite persistence and virulence were investigated. The infection dynamics of an array of AMPs-selected bacteria versus sensitive unselected control strains were monitored. Our laboratory, previously, showed that the AMP-selected strains harboured a mutation in either nsa or pmt operons. To measure the genetic costs of evolving resistance to these immunological stressors, the bacterial loads, were reanalyzed based on the resistance driving mutation. The induced host mortality rate inferred the virulence of the AMP-resistant pathogen. The findings in chapter 1 showed that, unexpectedly, a pathogen resistant to one or two of the host’s own AMPs neither had increased bacterial load nor affected the host’s survival rate. Costs of resisting AMP were presumably high, suggesting that intrinsic costs might constrain natural AMP resistance. As AMP-resistant pathogen showed limited infection success, this might explain the hampered AMP resistance evolution observed in environmental bacteria. Despite being resistant to one or two of the host’s own AMPs, S. aureus did not perform well in the beetle. The thesis investigated reasons that might cause such unexpected limited pathogenicity. The study, herein, hypothesized that an AMP-resistant pathogen might be more susceptible to eradication by host’s other immune effectors. However, in chapter 1, all AMP-resistant pathogens were shown to be phagocytosis resistance except those harbouring mutation in both nsa and rpo operons. In chapter 2, RNA interference-based knockdown study was performed to investigate the collateral sensitivity of AMP-resistant pathogen towards the host’s other immune effectors. The results highlighted that AMP-selected S. aureus strains are cross-sensitive towards phenoloxidase dependent immune responses, except the nsa-rpo mutants, which were, uniquely, resistant to phenoloxidase activity. Furthermore, collateral sensitivity to other AMPs of the in vivo defence cocktail was investigated. Strains harbouring mutations in pmt or both nsa and rpo operons showed cross-sensitivity to one or more component of the in vivo AMP defence cocktail. In conclusion, resistance against AMPs and phagocytosis neither influenced the host’s morbidity nor mortality because it is balanced by collateral sensitivity to other immune effectors. Despite being essential for infection success in vertebrates, AMP resistance does not provide a survival advantage to S. aureus in a host environment that is dominated by AMPs because of collateral sensitivity to other immune effectors. It was interesting to investigate whether bacterial evolution of AMP resistance triggers fitness-adaptive modifications to their growth parameters and pharmacodynamic parameters in vitro. In chapter 1, the defensin- (tenecin 1) selected S. aureus showed an extended lag phase compared to the sensitive unselected control. However, the maximum velocity of bacterial multiplication was not affected by AMP resistance evolution. In chapter 3, a four-parameter pharmacodynamic model was used to analyze time-kill curves of AMP-resistant S. aureus strains. The comparative analysis of pharmacodynamic curves of pexiganan, melittin and tenecin-resistant S. aureus demonstrated that the Hill coefficient, kappa, describing the steepness of the pharmacodynamic curve evolves. Kappa was usually ignored or set to a constant value in most pharmacodynamic models. Such a finding is crucial, as it was shown, previously, that the kappa relates to the probability of resistance evolution against AMPs. Medical practitioners routinely perform pharmacodynamic analysis for various drugs. However, the results in chapter 3 clarified that pathogens showed different pharmacodynamics evolution patterns, which should be considered, for example, when optimizing the choice of a new drug candidate in cycling therapy. Moreover, this finding could be extended to all kind of host-pathogen relationship. Pharmacodynamic parameters evolution should not be over-simplified to minimum inhibition concentration (MIC) when studying co-evolution to host’s AMP defence cocktail or other antimicrobials; this might enrich our perception of drug resistance evolutionary dynamics. Collectively, the thesis revealed that AMP resistance displayed, mostly, high fitness costs both in vivo and in vitro. This impaired pathogen fitness plays a decisive role in supporting AMPs as therapeutics. Some AMP-resistant mutants showed increased infection success than others. Therefore, for any AMPsbased therapy, a survey of fitness costs of possible evolving resistant pathogen mutants should be evaluated. Weighing the pros and cons of AMPs as therapeutics and avoiding unintentional evolution of felicitous AMP-resistant superbugs are tremendously important.Wechselwirkungen zwischen der Abwehrreaktion des Wirtes und Pathogenität des Parasiten determinieren den Ausgang einer Infektion. Antimikrobielle Peptide (AMPs) spielen bei der Immunabwehr von mehrzelligen Organismen eine essenzielle Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden die Fitnesskosten der Resistenzevolution gegenüber Wirt AMPs untersucht. Kapitel 1 fokussiert auf die In-vivo-Fitnesskosten für die Evolution von AMP-Resistenzen. Als Wirt wurde der Mehlwurmkäfer Tenebrio molitor verwendet. Der opportunistische Erreger Staphylococcus aureus wurde in T. molitor injiziert und selektierte gegen ein oder zwei der im Käfer vorhandenen AMPs. Untersucht wurden die Beständigkeit und Virulenz des AMP-resistenten Parasiten. Ich habe die Infektionsdynamik eines Array-AMP-ausgewählten Bakteriums gegenüber empfindlichen nicht selektierten Kontrollstämmen überwacht. Unser Labor hat zuvor gezeigt, dass die AMP-ausgewählten Stämme eine Mutation in nsa- oder pmt-Operons aufwiesen. Um die genetischen Kosten für die Entwicklung einer Resistenz gegen diese immunologischen Stressoren zu messen, wurde die Bakterienladung basierend auf der Mutation, die die Resistenz antreibt, erneut analysiert. Wir haben die Virulenz des AMP-resistenten Pathogens als induzierte Wirtssterblichkeitsrate abgeleitet. Die Ergebnisse in Kapitel 1 zeigten, dass ein Krankheitserreger, der gegen ein oder zwei AMPs des Wirts resistent war, unerwartet weder die Bakterienladung erhöht noch die Überlebensrate des Wirts beeinflusst hatte. Die Kosten für die Resistenz gegen AMPs waren vermutlich hoch, was darauf hindeutet, dass die Eigenkosten die natürliche AMP-Resistenz einschränken könnten. Da AMPresistente Pathogene einen begrenzten Infektionserfolg zeigten, könnte dies die erschwerte Entwicklung der AMP-Resistenz erklären, die bei Umweltbakterien beobachtet wurde. Obwohl S. aureus gegen ein oder zwei AMPs des Wirts resistent war, zeigte es im Käfer keine außerordentliche Pathogenität. Wir untersuchten Gründe, die eine solch unerwartet begrenzte Pathogenität verursachen könnten. In der vorliegenden Studie wurde die Hypothese aufgestellt, dass ein AMP-resistenter Erreger anfälliger für die Ausrottung durch die anderen Immuneffektoren des Wirts ist. In Kapitel 1 wurde jedoch gezeigt, dass alle AMP-resistenten Pathogene eine Phagozytose-Resistenz aufweisen, mit Ausnahme derjenigen, die sowohl in nsa- als auch in rpo-Operons Mutationen aufweisen. In Kapitel 2 wurde eine auf RNA-Beeinträchtigung basierende Knockdown-Studie durchgeführt, um die Kollateralempfindlichkeit von AMP-resistenten Pathogenen gegenüber den anderen Immuneffektoren des Wirts zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass ein AMP-selektierter S. aureus Stamm gegenüber Phenoloxidase-abhängigen Immunantworten kreuzempfindlich ist, mit Ausnahme der nsa-rpo Mutanten, die eindeutig gegen Phenoloxidase aktivität resistent waren. Darüber hinaus wurde die Kollateralempfindlichkeit gegenüber anderen AMPs des In-vivo-Abwehrcocktails untersucht. Stämme, die Mutationen in pmt- oder sowohl nsa- als auch rpo-Operons enthielten, zeigten eine Kreuzempfindlichkeit gegenüber einer oder mehreren Komponenten des in vivo-AMPAbwehrcocktails. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Resistenz gegen AMPs und Phagozytose weder die Morbidität noch die Mortalität des Wirts beeinflussen, da sie durch die Kollateralempfindlichkeit gegenüber anderen Immuneffektoren ausgeglichen wird. Obwohl die AMP-Resistenz für den Infektionserfolg bei Wirbeltieren wesentlich ist, bietet sie S. aureus in einer Wirtsumgebung, die aufgrund der Kollateralempfindlichkeit gegenüber anderen Immuneffektoren von AMPs dominiert wird, keinen Überlebensvorteil. Es war interessant, ob die AMP-Resistenz die Bakterienwachstumsparameter und die pharmakodynamischen Parameter beeinflussen könnte. In Kapitel 1 konnte ich zeigen, dass das von S. aureus ausgewählte Defensin (tenecin 1) eine verlängerte Verzögerungsphase im Vergleich zur empfindlichen nicht ausgewählten Kontrolle hervorruft. Die maximale Geschwindigkeit der Bakterienvermehrung wurde jedoch durch die Entwicklung der AMP-Resistenz nicht beeinflusst. In Kapitel 3 wurde ein pharmakodynamisches Vier-Parameter-Modell verwendet, um Time-Kill-Kurven von AMP-resistenten S. aureus-Stämmen zu analysieren. Die vergleichende Analyse der pharmakodynamischen Kurven von pexiganan-, melittin- und tenecin-resistenten S. aureus zeigte, dass sich der Hill-Koeffizient Kappa, der die Steilheit der pharmakodynamischen Kurve beschreibt, evolviert. Kappa wird in den meisten pharmakodynamischen Modellen ignoriert oder auf einen konstanten Wert gesetzt. Ein solches Ergebnis ist entscheidend, wie zuvor gezeigt wurde, weil sich das Kappa auf die Wahrscheinlichkeit der Resistenzentwicklung gegen AMPs bezieht. Ärzte führen routinemäßig pharmakodynamische Analysen für verschiedene Medikamente durch. Die Ergebnisse aus Kapitel 3 verdeutlichten jedoch, dass Krankheitserreger unterschiedliche pharmakodynamische Evolutionsmuster aufweisen, die beispielsweise bei der Optimierung der Auswahl eines neuen Medikamentenkandidaten in der periodischen Therapie berücksichtigt werden sollten. Darüber hinaus könnte dieser Befund auf alle Arten von Wirt-Pathogen-Beziehungen ausgedehnt werden. Die Entwicklung der pharmakodynamischen Parameter sollte für MIC nicht zu stark vereinfacht werden, wenn die Koevolution zum AMP-Abwehrcocktail des Wirts oder anderen antimikrobiellen Mitteln untersucht wird. Dies könnte unsere Wahrnehmung der evolutionären Dynamik der Arzneimittelresistenz bereichern. Insgesamt ergab die Arbeit, dass die AMP-Resistenz sowohl in vivo als auch in vitro meist hohe Fitnesskosten aufweist. Diese beeinträchtigte Fitness von AMP-Pathogenen spielt eine entscheidende Rolle bei der Unterstützung von AMPs als Therapeutika. Einige AMP-resistente Mutanten zeigten einen höheren Infektionserfolg als andere. Daher sollte für jede AMP-basierte Therapie eine Untersuchung der Fitnesskosten möglicher sich entwickelnder resistenter Pathogenmutanten ausgewertet werden. Es ist enorm wichtig, die Vor- und Nachteile von AMPs als Therapeutika abzuwägen und die unbeabsichtigte Entwicklung von AMP-resistenten Superbugs zu vermeiden

In vivo exposure of insect AMP resistant Staphylococcus aureus to an insect immune system

Antimicrobial peptides (AMPs) are important immune effectors in insects. Bacteria have a limited number of ways to resist AMPs, and AMP-resistance is often costly. Recently, it has become clear that AMP activities in vitro and in vivo differ. Although some studies have followed the in vivo survival of AMP resistant pathogens, studying a pathogen resistant to the AMPs of that particular host has never been reported. Here, we infected the mealworm beetle Tenebrio molitor with Staphylococcus aureus strains that were evolved in vitro in the presence of one or two antimicrobial peptides from T. molitor. We found that the Tenebrio immune system could clear mutant Tenecin resistant strains at least as efficiently as sensitive controls. The bacterial load of Tenecin resistant S. aureus segregated by mutation. Strains with mutations in both the pmt and rpo operons showed the highest in vivo survival and therefore showed the lowest fitness cost amongst the evolved resistance mutations. In contrast, Tenecin resistant strains with mutations in the nsa and rpo operons showed much lower survival within the hosts. Our study shows that Tenecin resistant strains are phagocytosed at a lower rate. The nsa/rpo mutants were phagocytosed at a higher rate than other Tenecin resistant S. aureus strains. The differences in resistance against AMPs and phagocytosis did not translate into changes in virulence. AMP resistance, while a prerequisite for an infection in vertebrates, does not provide a survival advantage to S. aureus in a host environment that is dominated by AMPs.</p

Genomics of experimental adaptation of Staphylococcus aureus to a natural combination of insect antimicrobial peptides

Abstract Antimicrobial peptides (AMP) are highly conserved immune effectors across the tree of life and are employed as combinations. In the beetle Tenebrio molitor, a defensin and a coleoptericin are highly expressed in vivo after inoculation with S. aureus. The defensin displays strong in vitro activity but no survival benefit in vivo. The coleoptericin provides a survival benefit in vivo, but no activity in vitro. This suggests a potentiating effect in vivo, and here we wanted to investigate the effects of this combination on resistance evolution using a bottom-approach in vitro starting with a combination of two abundant AMPs only. We experimentally evolved S. aureus in the presence of the defensin and a combination of the defensin and coleoptericin. Genome re-sequencing showed that resistance was associated with mutations in either the pmt or nsa operons. Strains with these mutations show longer lag phases, slower Vmax, and nsa mutants reach lower final population sizes. Mutations in the rpo operon showed a further increase in the lag phase in nsa mutants but not in pmt mutants. In contrast, final MICs (minimum inhibitory concentrations) do not differ according to mutation. All resistant lines display AMP but not antibiotic cross-resistance. Costly resistance against AMPs readily evolves for an individual AMP as well as a naturally occurring combination in vitro and provides broad protection against AMPs. Such non-specific resistance could result in strong selection on host immune systems that rely on cocktails of AMPs

Antimicrobial Peptide Induced-Stress Renders Staphylococcus aureus Susceptible to Toxic Nucleoside Analogs

Cationic antimicrobial peptides (AMPs) are active immune effectors of multicellular organisms and are also considered as new antimicrobial drug candidates. One of the problems encountered when developing AMPs as drugs is the difficulty of reaching sufficient killing concentrations under physiological conditions. Here, using pexiganan, a cationic peptide derived from a host defense peptide of the African clawed frog and the first AMP developed into an antibacterial drug, we studied whether sub-lethal effects of AMPs can be harnessed to devise treatment combinations. We studied the pexiganan stress response ofStaphylococcus aureusat sub-lethal concentrations using quantitative proteomics. Several proteins involved in nucleotide metabolism were elevated, suggesting a metabolic demand. We then show thatStaphylococcus aureusis highly susceptible to antimetabolite nucleoside analogs when exposed to pexiganan, even at sub-inhibitory concentrations. These findings could be used to enhance pexiganan potency while decreasing the risk of resistance emergence, and our findings can likely be extended to other antimicrobial peptides