Interaction of different tRNAs with translation elongation factors 1A from lower and higher eukaryotes

The work is aimed at confirmation of earlier assumed mechanism of tRNA channeling. Methods. The methods of band shift assay and Forsters resonance energy transfer were used. Results. The affinities of mammalian tRNAs for two tissue specific isoforms of elongator factor eEF1A1 and eEF1A2 were compared. For the first time we have shown the ability of yeast eEF1A*GDP to form non-canonical ternary complex with deacylated tRNAs. The complexation of eukaryotic eEF1A with initiator tRNA, of both bacterial and mammalian origin, was also demonstrated. Conclusions. The formation of the non-canonical complexes of eEF1A*GDP with deacylated tRNAs is common for higher and lower eukaryotes, which is in favor of universality of eukaryotic tRNA-channeling.Мета. Підтвердити запропонований раніше механізм каналювання тРНК. Методи. Зсув смуги в поліакриламідному гелі та Форстерівське резонансне перенесення енергії (FRET). Результати. Оцінено спорідненість тРНК ссавців з двома тканино-специфічними ізоформами фактораe еEF1A1 та eEF1A2. Вперше показано формування неканонічних потрійних комплексів дріжджового eEF1A*GDP з деацильованими тРНК. Продемонстровано також комплексоутворення еукаріотного eEF1A з ініціаторною тРНК ссавців і бактерій. Висновки. Формування неканонічних комплексів eEF1A*GDP з деацильованими тРНК є загальним для вищих і нижчих еукаріотів, що підтверджує універсальність еукаріотного каналювання тРНКЦель. Подтвердить предложенный ранее механизм каналирования тРНК. Методы. Сдвиг полосы в полиакриламидном геле и Форстеровский резонансный перенос энергии (FRET). Результаты. Оценено сродство тРНК млекопитающих с двумя тканеспецифическими изоформами фактора eEF1A1 и eEF1A2. Впервые показано формирование неканонических тройных комплексов дрожжевого eEF1A*GDP с деацилированными тРНК. Также продемонстрировано комплексообразование эукариотного eEF1A с инициаторной тРНК млекопитающих и бактерий. Выводы. Формирование неканонических комплексов eEF1A*GDP с деацилированными тРНК является общим для высших и низших эукариотов, что подтверждает универсальность эукариотного каналирования тРНК

In silico approach to study and functionally analyze interferon regulated genes

Finding genes which have biologically meaningful ISRE (interferon-stimulated response element) is important for better understanding of the Jak-STAT activated cellular IFN response. We used transcription factor binding site (TFBS) search with gene orthology filtering to find putative ISREs in the promoters of protein-coding genes of Rattus norvegicus, and used Gene Ontology (GO) analysis to check the validity of ISRE search results in terms of biological meaning. A total of 23286 promoters of rat genes were analyzed. ISRE search with 80 % threshold produced 5214 sites in 4571 promoters. 850 ISREs in 768 promoters passed orthology filtering. Distribution of ISREs along the promoter in 768-gene set reveals 3 regions of ISRE localization: 0 to –250, –250 to –550, and above –550 relative to TSS (transcription start site). It is not yet known whether ISRE localization has any functional implications. Using BayGO, a total of 84 GO terms were found to be enriched at P < 0.05 in the 768-gene set. Among these categories some are directly related to known IFN actions (positive regulation of B cell differentiation, humoral immune response, response to virus, cell differentiation etc.). 768 gene set was compared to the 4571 gene set using GO Tree Machine. Such categories as cell differentiation, cell cycle, regulation of cell cycle, viral life cycle and some others were found to be enriched, and belong to the well-known domains of interferon actions. Their relative enrichment is an indirect indication that the applied orthology filtering does increase the quality of results. Gene orthology-based filtering of the initial TFBS search results was shown to produce viable and expected results. Genes identified in this research as containing ISRE in promoters will be used to seed the construction of the IFN-a-induced gene regulatory network.Пошук генів, які містять у промоторі біологічно значущий сайт ISRE (interferon-stimulated response element), необхідний для вдосконалення сучасних уявлень про опосередковану Jak-STAT стимуляцію клітин інтерфероном. Для виявлення імовірних ISRE у промоторах кодуючих білок генів Rattus norvegicus використано метод пошуку сайтів зв’язування із додатковим відбором результатів за наявнiстю сайта в промоторах мишачих генів-ортологів. Придатність методу пошуку ISRE з точки зору біологічної значущості перевіряли за допомогою функціонального аналізу виявлених генів з використанням GO (Gene Ontology). Проаналізовано 23286 промоторів генів щура. Пошук ISRE з порогом подібності 80 % виявив 5214 сайтів у 4571 промоторі. Після відбору за ортологією отримано 850 елементів ISRE у 768 промоторах. У розташуванні знайдених ISRE можна виділити три основні ділянки: від 0 до –250, від –250 до –550 та вище за –550-ту позицію відносно точки початку транскрипції. Поки незрозуміло, чи пов’язані між собою розташування ISRE та його функції. Використовуючи BayGO, у групі із 768 генів виявлено 84 відносно збагачені категорії GO з Р < 0,05. Деякі з цих категорій належать до відомих ефектів інтерферону (позитивна регуляція диференціації B-клітин, гуморальна імунна відповідь, відповідь на вірус, клітинна диференціація тощо). За допомогою GO Tree Machine порівняно функціональні категорії в групах із 768 та 4571 гена. Такі функціональні категорії, як клітинна диференціація, клітинний цикл, регуляція клітинного циклу, вірусний життєвий цикл та деякі інші, належать до відомих мішеней інтерферону. Їхнє відносне збагачення після відбору за ортологією є непрямим доказом того, що застосування зазначеного підходу дає змогу підвищити якість результатів. У цілому пошук сайта зв’язування із наступним відбором за ортологією дозволив отримати значущі та очікувані результати. Гени, у промоторах яких знайдено ділянку ISRE, стануть підгрунтям для створення мережі генної регуляції, стимульованої інтерфероном.Поиск генов, содержащих в промоторе биологически значимый сайт ISRE (interferon-stimulated response element), является важной частью дальнейшего изучения опосредованной Jak-STAT стимуляции клеток интерфероном. Для определения вероятных ISRE в промоторах кодирующих белок генов Rattus norvegicus мы использовали метод поиска сайтов связывания с дополнительным отбором результатов по признаку наличия сайта в промоторе мышиных генов-ортологов. Пригодность метода поиска ISRE с точки зрения биологического значения проверяли с помощью функционального анализа найденных генов с использованием онтологии генов (GO, Gene Ontology). При анализе 23286 промоторов генов крысы с порогом сходства с матрицей ISRE 80 % выявлены 5214 сайтов в 4571 промоторе. Отбор по ортологии прошли 850 ISRE в 768 промоторах. В расположении обнаруженных элементов ISRE можно выделить три основных участка: от 0 до –250, от –250 до –550 и выше –550 относительно точки начала транскрипции. Пока не понятно, есть ли связь между расположением ISRE и его функцией. Используя BayGO, в группе из 768 генов вычислены 84 обогащенные категории GO при Р < 0,05. Некоторые из этих категорий непосредственно связаны с известными эффектами интерферона (позитивная регуляция дифференциации B-клеток, гуморальный иммунный ответ, ответ на вирус, клеточная дифференциация и др.). При помощи GO Tree Machine мы сравнили функциональные категории в группах из 768 и 4571 гена. Такие функциональные категории, как клеточная дифференциация, клеточный цикл, регуляция клеточного цикла, жизненный цикл вирусов и некоторые другие, принадлежат к известным мишеням интерферона. Их относительное обогащение после отбора по признаку ортологии является косвенным доказательством того, что применение отбора по ортологии позволяет улучшить качество полученных результатов. В целом поиск сайта связывания с последующим отбором по признаку ортологии позволил получить значимые и ожидаемые результаты. Гены, в промоторах которых найден сайт ISRE, будут использованы для для создания сети генной регуляции, стимулируемой интерфероном

Conductometric urease microbiosensor based on thin-film interdigitated electrodes for urea determination

The characteristics of conductometric urease microbiosensor based on thin-film inter-digitated electrodes for urea determination have been studied. Urease has been immobilized by cross-linking with bovine serumalbumin using glutaraldehyde. The resulting conductivity changes are produced by enzymatically catalyzed hydrolysis of urea. This process for both immobilized enzyme and soluble one is described by the classic laws of enzymatic kinetics. The influence of ionic strength, pH and buffer capacity of the samples on the biosensor response has been thoroughly tested. The results have been discussed concerning urea concentration analysis in human blood.Вивчено характеристики кондуктометричного уреазного біосенсора для визначення сечовини на основі тонкоплівкових гребінчастих електродів. Уреазу іммобілізовали ковалентною зшивкою з сироватковим альбуміном бика за допомогою глутарового альдегіду. Результуючі зміни провідності викликано ферментативним гідролізом сечовини. Згаданий процес як для іммобілізова­ ного, так і для вільного ферменту описується класичними законами ферментативної кінетики. Досліджено вплив на величину відгуку іонної сили, рН та буферної ємності розчину. Розглянуто питання стосовно визначення концентрації сечовини у крові людини.Изучены характеристики кондуктометрического уреазного микробиосенсора для определения мочевины на основе тонкопленочных гребенчатых электродов. Уреазу иммобилизовали ковалентной сшивкой с бычьим сывороточным альбумином с помощью глутарового альдегида. Результи­рующее изменение проводимости вызвано ферментативным гидролизом мочевины. Этот про­цесс как для иммобилизованного, так и для свободного фермента описывается классическими законами ферментативной кинетики. Исследовано влияние на величину отклика ионной силы, рН и буферной емкости раствора Рассмотрены вопросы, связанные с определением концентра­ ции мочевины в крови человека

Multisubunit complex eEF1H in human glial tumors: from mRNA to protein

Aim. To investigate protein level of all subunits of the eukaryotic elongation translation factor eEF1H (eEF1A, eEF1Bα, eEF1Bβ and eEF1Bγ) in glial tumors of human brain in comparison with normal brain. Methods. The eEF1H components content has been investigated in human glioblastoma clinical samples by Western blot analysis. Results. To determine the eEF1Bα, eEF1Bβ and eEF1Bγ content, the polyclonal antibodies against all eEF1H subunits were obtained. The tendency of the eEF1Bγ protein level to increase in glioblastomas was observed. There were no significant differences in the eEF1A, eEF1Bα and eEF1Bβ protein contents. Conclusions. In the previous report we analysed the expression of all eEF1H subunits in human glial brain tumor on the mRNA level. This study showed that eEF1Bγ was overexpressed while no significant changes in other eEF1H subunits were observed. It suggests a possible function of eEFBγ which is cancer-related and is not connected with the functioning of eEF1H complex in translation.Мета. Проаналізувати вміст усіх субодиниць фактора елонгації трансляції eEF1H (eEF1A, eEF1Bα, eEF1Bβ і eEF1Bγ) в гліальних пухлинах головного мозку людини порівняно з умовною нормою. Методи. Компоненти комплексу eEF1H досліджували у клінічних зразках гліальних пухлин людини Вестерн-блот-аналізом. Результати. Для визначення вмісту білків eEF1Bα, eEF1Bβ і eEF1Bγ отримано поліклональні антитіла до цих субодиниць. Спостерігали тенденцію до підвищення рівня білка eEF1B в гліобластомах. Відмінності в рівні білків eEF1A, eEF1Bα та eEF1Bβ в гліальних пухлинах у порівнянні з умовною нормою виявилися несуттєвими. Висновки. Ця робота є продовженням попередніх досліджень, де вивчали рівень мРНК, які кодують субодиниці комплексу eEF1H у пухлинах головного мозку людини. Виявлене зростання концентрації білка eEF1Bγ в гліобластомах, що відбувалося на фоні практичної відсутності розбіжностей в експресії інших субодиниць комплексу, може свідчити про виконання субодиницею eEF1Bγ певної пухлинозалежної ролі, окремої від трансляційної функції комплексу eEF1H.Цель. Проанализировать содержание всех субъединиц фактора элонгации трансляции eEF1H (eEF1A, eEF1Bα, eEF1Bβ и eEF1Bγ) в глиальных опухолях головного мозга человека по сравнению с условной нормой. Методы. Компоненты комплекса eEF1H исследовали в клинических образцах глиальных опухолей человека Вестерн-блот-анализом. Результаты. Для определения содержания белков eEF1Bα, eEF1Bβ и eEF1Bγ получены поликлональные антитела против этих субъединиц. Наблюдалась тенденция к повышению уровня белка eEF1Bγ в глиобластомах. Отличия в уровнях белков eEF1A, eEF1Bα и eEF1Вβ оказались несущественными. Выводы. Эта работа продолжает предыдущие исследования по изучению уровня мРНК, кодирующих субъединицы комплекса eEF1H в опухолях головного мозга человека. Выявленное увеличение концентрации белка eEF1Bγ в глиобластомах, происходящее на фоне практически отсутствующих изменений в уровнях экспрессии других субъединиц комплекса, может указывать на выполнение субъединицей eEF1Bγ определенной опухоль-зависимой роли, отдельной от трансляционного комплекса eEF1H

mRNAs coding for A1 and A2 isoforms of translation factor eEF1A demonstrate different half-lives while A1 and A2 proteins are similarly stable in MCF7 cells

Eukaryotic translation elongation factor 1A (eEF1A) exists as two 98 % homologous isoforms eEF1A1 and eEF1A2 that are tissue/development specific and differentially linked to apoptosis/cancerogenesis. A2 is overexpressed in a number of tumors while unusual expression of A1 is observed in injured muscles. To approach a possible mechanism underlying induced changes in the relative amounts of the isoforms we examined the intrinsic stability of the proteins and their mRNAs in human cancer cells. Aim. To estimate half-life of the isoforms of eEF1A at mRNA and protein level in human cancer cells. Methods. To measure mRNA stability the transcriptional block technique was applied, with subsequent analysis of the mRNA level by qPCR. To determine the protein decay rate the translation was blocked by cycloheximide and changes in the protein level were detected by Western blot. Results. Calculation of the protein stability revealed half-life of 72 for eEF1A1 and 95 hours for eEF1A2. Half-life of EEF1A1 and EEF1A2 mRNAs were 3 and 60 hours respectively. Conclusions. Despite similar protein stability, the isoforms of eEF1A dramatically differ in the half-lives of their mRNAs, suggesting that the mRNA decay mechanism is one of the main regulators of eEF1A1/A2 amount in MCF7 cancer cells.Евкаріотний фактор елонгації трансляції (eEF1A) існує у вигляді двох гомологічних на 98 % ізоформ eEF1A1 і eEF1A2, які є тканиноспецифічними, відрізняються за представленістю в онтогенезі та по-різному пов’язані з апоптозом і канцерогенезом. Згідно з попередніми даними, eEF1A2 має підвищений рівень експресії у деяких пухлинах, а eEF1A1 – у пошкоджених м’язах. Щоб зрозуміти механізм, за яким змінюється відносна кількість ізоформ, ми дослідили стабільність білків та їхніх мРНК у клітинах раку людини. Мета. Оцінити час напівжиття ізоформ eEF1A на рівні мРНК і білка в клітинах раку людини. Методи. Для вимірювання стабільності мРНК використано техніку блокування транскрипції з подальшим аналізом рівня мРНК із застосуванням кількісної ПЛР. Для визначення швидкості розпаду білка трансляцію блокували циклогексимідом, подальші зміни рівня білка виявляли методом Вестерн-блоту. Результати. За підрахунками, стабільність білка зберігалася протягом 72 год у разі eEF1A1 та 95 год – у разі eEF1A2. Значення часу напівжиття EEF1A1 і EEF1A2 мРНК становлять відповідно 3 і 60 год. Висновки. Незважаючи на подібні значення стабільності білка, ізоформи eEF1A значно відрізняються за часом напівжиття їхніх мРНК, внаслідок чого можна припустити, що контроль стабільності мРНК є одним з основних механізмів регуляції експресії eEF1A1/ A2 в клітинах раку молочної залози MCF7.Эукариотический фактор элонгации трансляции (eEF1A) существует в виде двух гомологичных на 98 % изоформ eEF1A1 и eEF1A2, являющихся тканеспецифическими, отличающихся представленностью в онтогенезе и по-разному связанных с апоптозом и канцерогенезом. Согласно наблюдениям, eEF1A2 имеет повышенный уровень экспрессии в некоторых опухолях, а eEF1A1 – в поврежденных мышцах. Чтобы понять механизм, по которому изменяется относительное количество изоформ, мы исследовали стабильность белков и их мРНК в клетках рака человека. Цель. Оценить время полужизни изоформ eEF1A на уровне мРНК и белка в клетках рака человека. Методы. Для измерения стабильности мРНК использовали технику блокирования транскрипции с последующим анализом уровня мРНК с применением количественной ПЦР. Для определения скорости распада белка трансляцию блокировали циклогексимидом, дальнейшие изменения уровня белка выявляли методом Вестерн-блота. Результаты. По расчетам, стабильность белка сохранялась в течение 72 ч в случае eEF1A1 и 95 ч – в случае eEF1A2. Время полужизни EEF1A1 и EEF1A2 мРНК составляло соответственно 3 и 60 ч. Выводы. Несмотря на подобные значения стабильности белка, изоформы eEF1A значительно отличаются по времени полужизни их мРНК, вследствие чего можно предположить, что контроль стабильности мРНК является одним из основных механизмов регуляции экспрессии eEF1A1/A2 в клетках рака молочной железы MCF7

Specific features of protein biosynthesis in higher eukaryotes

Over 40 years of studies in the field of higher eukaryotic translation are summarized in the review. Among the pioneer results obtained we should especially accentuate the following: i) discovery of the adaptation of tRNAs and aminoacyl-tRNA synthetases (ARSs) cellular pools to the synthesis of specific proteins and modulation of the elongation rate by rare isoacceptor tRNAs; ii) the chaperone-like properties of the translation components (ribosomes and elongation factor eEF1A); characterization of high molecular weight complexes of ARSs; iii) functional compartmentalization, including channeling of tRNA in eukaryotic cells; iv) molecular mechanisms of channeling mediated by different non-canonical complexes involving eEF1A, tRNA and aminoacyl-tRNA synthetases; v) characterization of the crystal structure of eEF1A2; vi) comparison of spatial structure, molecular dynamics, tyrosine phosphorylation and abilities to interact with different protein partners of the eEF1A1 and eEF1A2 isoforms; vii) discovery of the microRNA-mediated control of the expression of the proto-oncogenic eEF1A2 isoform in cancer cells; viii) examination of the cancer-related changes in translation elongation complex eEF1H and mechanisms of oncogene PTI-1 action; ix) discovery of the third tRNA binding site on mammals ribosomes and the allosteric interaction of the 80S ribosomal A and E sites.В огляд підсумовано найвагоміші результати більш ніж сорокалітніх досліджень особливостей трансляції у вищих евкаріотів, з-поміж яких: 1) відкриття адаптації клітинних пулів тРНК і аміноацил-тРНК синтетаз (АРСаз) до синтезу специфічних білків і модуляції швидкості елонгації рідкісними ізоакцепторними тРНК; 2) визначення шапероноподібних властивостей компонентів апарату трансляції (рибосом і фактора елонгації eEF1A), характеристика високомолекулярних комплексів АРСаз; 3) встановлення функціональної компартменталізації, у тому числі каналювання тРНК в евкаріотних клітинах; 4) з’ясування молекулярних механізмів каналювання, що відбувається за посередництвом різних неканонічних комплексів, які містять eEF1A, тРНК і АРС-ази; 5) характеристика кристалічної структури eEF1A2; 6) порівняння просторової організації, молекулярної динаміки, тирозинового фосфорилювання і здатності до взаємодії з різними білками – партнерами ізоформ eEF1A1 i eEF1A2; 7) виявлення ролі мікроРНК у контролі експресії протоонкогенної ізоформи eEF1A2 в ракових клітинах; 8) вивчення спричинених раком змін комплексу факторів елонгації трансляції eEF1H і механізмів дії онкогену PTI-1; 9) відкриття третього сайта зв’язування тРНК у рибосомах ссавців та алостеричної взаємодії А- і Е-сайтів 80S рибосоми.В обзоре суммированы наиболее значимые результаты более чем сорокалетнего исследования особенностей трансляции у высших эукариот, среди них: 1) открытие адаптации клеточных пулов тРНК и аминоацил-тРНК синтетаз (АРСаз) к синтезу специфических белков и модуляции скорости элонгации редкими изоакцепторными тРНК; 2) определение шапероноподобных свойств компонентов аппарата трансляции (рибосом и фактора элонгации eEF1A) и характеристика высокомолекулярных комплексов АРСаз; 3) установление функциональной компартментализации, включающей каналирование тРНК в эукариотных клетках; 4) выяснение молекулярных механизмов каналирования, опосредованного неканоническими комплексами, содержащими eEF1A, тРНК и АРС-азы; 5) характеристика кристаллической структуры eEF1A2; 6) сравнение пространственной организации, молекулярной динамики, тирозинового фосфорилирования и способности к взаимодействию с различными белками – партнерами изоформ eEF1A1 и eEF1A2; 7) выявление роли микроРНК в контроле экспрессии протоонкогенной изоформы eEF1A2 в раковых клетках; 8) изучение связанных с раком изменений комплекса факторов элонгации трансляции eEF1H и механизмов действия онкогена РТІ-1; 9) открытие третьего сайта связывания тРНК в рибосомах млекопитающих и аллостерического взаимодействия А- и Е-сайтов на 80S рибосомах

Isoforms of elongation factor eEF1A may be differently regulated at post-transcriptional level in breast cancer progression

Eukaryotic translation elongation factor 1A exists as two 98 % homologous isoforms: eEF1A1 (A1) and eEF1A2 (A2) which are tissue and development specific. Despite high homology in an open reading frame (ORF) region, mRNAs coding for eEF1A1 and eEF1A2 are different in their untranslated regions (UTR), suggesting a possibility of their dissimilar post-transcriptional regulation. Aim. To analyze the existence of cis-acting motifs in the UTRs of EEF1A1/A2 mRNAs, to confirm the possibility of post-transcriptional control of eEF1A1 and eEF1A2 expression. Methods. An ensemble of bioinformatic methods was applied to predict regulatory motifs in the UTRs of EEF1A1/A2 mRNAs. Dual-luciferase reporter assay was employed to detect post-transcriptional regulation of eEF1A1/A2 expression. Results. Numerous regulatory motifs in the UTR of EEF1A1/A2 mRNAs were found bioinformatically. The experimental evidence was obtained for the existence of negative regulation of EEF1A1 and positive regulation of EEF1A2 mRNA in the model of breast cancer development. Conclusions. EEF1A1 and EEF1A2 mRNAs contain distinct motifs in the UTRs and are differently regulated in cancer suggesting the possibility of their control by different cellular signals.Евкаріотний фактор елонгації трансляції 1А представлений двома тканиноспецифічними ізоформами А1 (eEF1A1) і A2 (eEF1A2), які гомологічні на 98 % і експресуються на різних стадіях розвитку організму. Незважаючи на високу гомологію кодуючої ділянки, мРНК ізоформ значно відрізняються за 5'- і 3'-нетрансльованими послідовностями (НТП). На основі даного факту можна припустити, що посттранскрипційний контроль експресії ізоформ А1 і А2 відбувається за різними механізмами. Мета. Експериментально перевірити вміст цис-регуляторних мотивів у НТП мРНК EEF1A1/ A2, а також наявність посттранскрипційного контролю експресії ізоформ. Методи. Регуляторні мотиви у НТП мРНК EEF1A1/A2 передбачено із застосуванням біоінформатичних методів. Існування посттранскрипційної регуляції експресії eEF1A1/ A2 підтверджено методом репортерних генів. Результати. Виявлено численні мотиви в НТП мРНК EEF1A1/A2. Отримано експериментальні дані, які засвідчують інгібування експресії мРНК EEF1A1 та стимулювання експресії мРНК EEF1A2 на посттрaнскрипційному рівні у клітинній моделі розвитку раку молочної залози. Висновки. мРНК ізоформ фактора елонгації EEF1A містять відмінні один від одного мотиви в НТП і по-різному регулюються в процесі злоякісного перетворення клітин, що передбачає ймовірність регулювання їхньої експресії на посттранскрипційному рівні у відповідь на клітинні сигнали.Эукариотический фактор элонгации трансляции 1А представлен двумя тканеспецифичными изоформами А1 (EEF1A1) и A2 (EEF1A2), гомологичными на 98 % и экспрессирующимися на разных стадиях развития организма. Несмотря на высокую гомологию в кодирующей области, мРНК изоформ имеют существенно различные 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности (НТП). На основе данного факта можно предположить, что посттранскрипционный контроль экспрессии изоформ А1 и А2 осуществляется по различным механизмам. Цель. Экспериментально проверить содержание цис-регуляторных мотивов в НТП мРНК EEF1A1/A2, а также наличие посттранскрипционного контроля экспрессии изоформ. Методы. Регуляторные мотивы в 3'НТП мРНК EEF1A1/1A2 предсказаны с применением биоинформатических подходов. Существование посттранскрипционной регуляции экспрессии мРНК eEF1A1/A2 подтверждено методом репортерных генов. Результаты. Выявлены многочисленные мотивы в НТП мРНК EEF1A1/ A2. Получены экспериментальные данные, свидетельствующие об ингибировании экспрессии мРНК EEF1A1, а также о стимулировании экспрессии мРНК EEF1A2 на посттранскрипционном уровне в клеточной модели рака молочной железы. Выводы. мРНК изоформ фактора элонгации eEF1A содержат различные мотивы в НТП и по-разному регулируются в процессе злокачественной трансформации клеток, что предполагает возможность регуляции их экспрессии на посттранскрипционном уровне в ответ на клеточные сигналы

Biosensors based on conductometric detection

The present paper is a self-review on the development of about 20 conductometric biosensors based on planar electrodes and containing different biological material (enzymes, cells, antibodies), bio-mimics or synthetic membranes, including Imprinting polymers, as a sensitive element. Highly specific, sensitive, simple, fast and cheap determination of different analytes makes them promising for needs of medicine, biotechnology, environmental control, agriculture and food industry. Non-specific interference of back-ground ions may be overcome by the differential mode of measurement, the usage of rather concentrated sample buffer and additional negatively or positively charged membranes, which decrease buffer capacity influence and extend a dynamic range of sensors response. For development of easy-to-use small conductometric immunosensors several approaches seem to be promising: i) the usage of polyaniline as electroconductive label for antibodies detection in competitive electroimmunoassay; ii) the elaboration of multilayer structures with phtalocyanine films; iii) the usage of acrylic copolymeric membranes. The advantages and disadvantages of conductometric biosensors created are discussed. For future commercialisation our effort are aimed to unite a thin-film technology with membranes deposition and to find the ways of membrane stabilisation, including bio-mimics creation, utilisation of bioaffinity polymeric membranes, imprinting polymers etc.Огляд присвячено аналізу власних робіт з розробки близько 20 кондуктометричних біосенсорів на основі планарних електродів та різноманітного біологічного матеріалу (ферменти, клітини, антитіла), синтетичних мембран як чутливих елементів. Висока селективність, чутливість, низька ціна, простота та експресність визначення різноманітних речовин роблять біосенсори необхідними для потреб медицини, біотехнологїі, екологи, сільського господарства та харчової промисловості. При аналізі реальних зразків неспецифічний вплив фонових електролітів можна суттєво зменшити завдяки використанню диференційного режиму вимірювань, більш концентрованих буферних розчинів, а також додаткових негативно чи позитивно заряджених мембран, які запобігають впливові буферної ємності та іонної сили розчинів і розширюють динамічний діапазон роботи сенсорів. Для створення мініатюрних імуносенсорів було запропоновано такі підходи: а) використання поліаніліну як електропровідної мітки при виз наче пні антитіл у конкурентному імуноаналізі: б) створення багатошарових структур з плівками фталоціаніну; в) використання акрилових сополімерних мембран. Обговорено переваги та недоліки розроблених кондуктометричних біосенсорів. Подальша комерціалізація таких приладів пов'язана з пошуком шляхів стабілізації чутливих мембран та суміщення тонкоплівкових технологій з нанесенням мембран у єдиному технологічному циклі.Обзор посвящен анализу собственных работ по разработке около 20 кондуктометрических биосенсоров на. основе планарных электродов и различного биологического материала, (ферменты, клетки, антитела) и синтетических мембран о качестве чувствительных элементов. Высокая селективность, чувствительность, дешевизна, простота и быстрота определения различных веществ делают биосенсоры необходимыми в медицине, биотехнологии, экологии, сельском хозяйстве и пищевой промышленности. При анализе реальных образцов неспецифическое влияние фоновых электролитов можно устранить благодаря использованию дифференциального режима измерений, более концентрированных буферных растворов, а также дополнительных отрицательно или положительно заряженных мембран, уменьшающих влияние буферной емкости и ионной силы растворов и расширяющих динамический диапазон работы сенсоров. Для создания миниатюрных иммуносенсоров предложены следующие подходы: а) использование полианилина как электропроводящей метки при определении антител в конкурентном иммуноанализе; б) создание многослойных структур с пленками на основе фталоцианина; в) использование акриловых со полимерных мембран. Обсуждены преимущества и недостатки разработанных кондуктометрических биосенсоров. Дальнейшая коммерциализация, таких приборов связана с поиском путей стабилизации чувствительных мембран и совмещения, тонкопленочной технологии с нанесением мембран в едином технологическом цикле

Biosensors. A quarter of a century of R&D experience

The paper is a review of the researches of Biomolecular Electronics Laboratory concerning the development of biosensors based on electrochemical transducers (amperometric and conductometric electrodes, potentiometric pH-sensitive field effect transistors) and different biorecognition molecules (enzymes, cells, antibodies), biomimics (molecularly imprinted polymers), as sensitive elements for direct analysis of substrates or inhibitory analysis of toxicants. Highly specific, sensitive, simple, fast and cheap detection of different substances renders them as promising tools for needs of health care, environmental control, biotechnology, agriculture and food industries. Diverse biosensor formats for direct determination of different analytes and inhibitory enzyme analysis of a number of toxins have been designed and developed. Improvement of their analytical characteristics may be achieved by using differential mode of measurement, negatively or positively charged additional semipermeable membranes, nanomaterials of different origin, genetically modified enzymes. These approaches have been aimed at increasing the sensitivity, selectivity and stability of the biosensors and extending their dynamic ranges. During the last 25 years more than 50 laboratory prototypes of biosensor systems based on mono- and multibiosensors for direct determination of a variety of metabolites and inhibitory analysis of different toxic substances were created. Some of them were tested in real samples analysis. The advantages and disadvantages of the biosensors developed are discussed. The possibility of their practical application is considered.Представлено огляд виконаних у лабораторії біомолекулярної электроніки досліджень в області розробки біосенсорів на основі електрохімічних перетворювачів (амперо- і кондуктометричні електроди, потеціометричні рН-чутливі польові транзистори) і різних біорозпізнавальних молекул (ферменти, клітини, антитіла), біоміміків або синтетичних мембран, включаючи матричні полімери, як чутливих елементів для прямого аналізу субстратів або інгібіторного аналізу токсинів. Завдяки високій специфічності і чутливості, простоті та низькій вартості визначення різних речовин біосенсори є перспективними приладами для потреб охорони здоров’я, контролю довкілля, біотехнології, сільського господарства і харчової промисловості. Розроблено й досліджено біосенсори для прямого визначення низки аналітів та інгібіторного аналізу різних токсичних речовин. Поліпшення їхніх аналітичних характеристик можна досягти за рахунок застосування диференційного режиму вимірювань, негативно або позитивно заряджених допоміжних напівпроникних мембран, наноматеріалів різного походження, генетично модифікованих ферментів тощо. Використання цих підходів зробить можливим підвищити чутливість, селективність і стабільність біосенсорів, а також розширити динамічний діапазон вимірювань. Упродовж останніх 25 років виготовлено більш як 50 лабораторних прототипів біосенсорних систем на основі моно- і мультибіосенсорів для прямого визначення різноманітних метаболітів та інгібіторного аналізу токсикантів. Деякі з них випробувано за умов аналізу реальних зразків. В огляді обговорено переваги і недоліки розроблених біосенсорів та розглянуто можливості їхнього практичного застосування.Представлен обзор выполненных в лаборатории биомолекулярной электроники исследований в области разработки биосенсоров на основе электрохимических преобразователей (амперо- и кондуктометрические электроды, потециометрические рН-чувствительные полевые транзисторы) и различных биораспознающих молекул (ферменты, клетки, антитела), биомимиков или синтетических мембран, в том числе матричных полимеров, в качестве чувствительных элементов для прямого анализа субстратов или ингибиторного анализа токсинов. Благодаря высокой специфичности и чувствительности, простоте и дешевизне оп- ределения различных веществ биосенсоры представляют собой перспективный инструментарий для потребностей здравоохранения, контроля окружающей среды, биотехнологии, сельского хозяйства и пищевой промышленности. Разработаны и исследованы биосенсоры для прямого определения ряда аналитов и ингибиторного ферментного анализа различных токсичных веществ. Улучшения их аналитических характеристик можно достичь за счет применения дифференциального режима измерений, негативно или позитивно заряженных дополнительных полупроницаемых мембран, наноматериалов разного происхождения, генетически модифицированных ферментов и др. Эти подходы дают возможность повысить чувствительность, селективность и стабильность биосенсоров, расширить их динамический диапазон измерений. В течение последних 25 лет изготовлено более 50 лабораторных прототипов биосенсорных систем на основе моно- и мультибиосенсоров для прямого определения разнообразных ме- таболитов и ингибиторного анализа различных токсикантов. Некоторые из них исследованы в условиях анализа реальных об- разцов. В обзоре обсуждаются достоинства и недостатки разра- ботанных биосенсоров. Рассматривается возможность их прак- тического использования