特発性男性不妊症患者に対するY染色体パリンドローム複合体の分析と多型性検索

Y染色体のゲノム塩基配列が公開されると、相同性の高い反復配列とパリンドローム構造であることが明らかとなった。Y染色体上の大きなパリンドローム構造は8種あり、精子形成候補領域のひとつであるAZFcにはふたつのパリンドローム複合体が存在している。我々は、パリンドローム単位で欠失が生じているという仮定のもとに、無・高度乏精子症患者ゲノムDNAを用いて、AZFcパリンドローム複合体の有無について検討した。まず、現在多用されている多コピー遺伝子や反復・繰返し配列の多いAZFc内部の欠失を確認することは従来のSTS-PCR法では理論的に不可能である。したがって、ゲノム塩基配列から、それぞれのプローブに対応するコピー数をreal-time quantitative PCR (RTQ PCR)によって確認し、特発性男性不妊症との関係について検討した。まず、定量化するために内部標準DNAを鋳型にして標準曲線を作成した。この鋳型は常染色体上の単一遺伝子であるRNAase P遺伝子を使用し、各サンプルのゲノムDNA量のばらつきを補正した。各患者サンプルの鋳型DNA量を10ngとし、RTQ-PCRを40サイクル行った。RTQ-PCRより算出できるコピー数比から、パリンドローム内部における微小欠失を検出することが可能となった。特に、パリンドローム部分欠失の検出は理論上無理とされていたが、ゲノムデータベースを基礎に男性不妊症でその部分欠失の存在を証明した。AZFc領域にあるP1+P2欠失のみならず、P1部分欠失の方法を確立した。今回使用したRTQ-PCR法において、従来のSTS-PCR法では欠失を認められない症例にも、AZFc領域内部に微小欠失が存在していることが明らかとなった。従来考えられていたよりも多くの特発性男性不妊症患者にAZFc領域の微小欠失が存在している可能性が考えられた。Background :In 2003, the whole sequence of the Y chromosome has been determined following the completion of the human genome project. As a result, huge identical sequences have been found to be present massive Y-specific repeat called amplicons on the distal side of the euchromatic region of the long arm of the Y chromosome, and these amliconic regions have formed a massive palindrome complex. The palindromes in the AZFc region are consists of a complex of several small segments. These ampliconic sequences pairs are characterised by palindromes showing nearly more than 99.9% identy. Sequence tagged site (STS) markers are now available for detection of the position of palindromes. The AZFc region is comprised completely of amplicons and is particularly susceptible to deletion. The b2/b4 deletion is eliminated the entire AZFc region and cause the spermatogenetic failure. Some papers reported partial deletions within AZFc are present in some infertile male. Conventional PCR is not evaluat ed a copy number, but, real-time PCR assay that may be adaptable for estimating several identical sequence sites as copies numbers.The objective of the present study was to evaluate the multiple sites which is identical to sequences using the quantitative detection of copies by real-time fluorescence PCR as a new molecular diagnostic parameter in the genome DNA from patients presenting with non-obstructive azoospermia. Here we apply quantitative real-time PCR as an alternative approach to measure DNA copy number changes at each AZF region of the human Y chromosome.We selcted the probes such as sY 142 (G38345), sY 254 (G38349), sY 579 (G63909), sY 602 (G34986), sY 627 (G67175), sY 639 (G67162), sY 1054(G6716), sY 1125 (G67164), sY 1190 (G67165), sY 1192 (G67166), sY 1196 (G67167), sY 1197 (G67168), sY 1198 (G67169), sY 1201 (G67170), sY 1206 (G67171). We modified these primers size for real time PCR, so that the PCR products products is amplified approximately 100 base pairs and hybridization probes within each primer and dual-labelled flurogenic probes (hybridization probe) is designed between these selected modified primers. These amplicons and corresponding primers that showed a unique BLAST hit were selected and used in further experiments.The region of AZFc are present one or more identifical sequences per genome because of their palindromic structures. As more several retetive sequence exist, the possibility of partial deletion within AZFc is present.We here demonstrated the application of a new, flexible, fast, and precise real-time PCR based estimation the copy number of identical sequences in Y chromosome ampliconic region.研究課題/領域番号:15591677, 研究期間(年度):2003-2004出典：「特発性男性不妊症患者に対するY染色体パリンドローム複合体の分析と多型性検索」研究成果報告書　課題番号15591677(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

ゲノム病としての前立腺がん-内因性レトロウイルスとアンドロゲン調節領域-

金沢大学医学系内因性レトロウイルス(endogenous retrovirus ; ERV)はTransposal element(TE)のひとつであり、ヒトゲノムの半分以上を占める。ERVはLTR(long terminal repeat)を特徴とし、このLTRの相同性によって再組換えが生じると考えられている。ERVは感染によって1)遺伝子調節領域のpromoter化2)エクソン化3)遺伝子末端のアデニール化などを惹起させ、本来のゲノムに影響を与える。昨年度では、前立腺癌に関与する遺伝子として、a)エストラジオールを産生する酵素CYP19(aromatase)、b)ACPP(酸性フォスファターゼ)c)テストステロンを産生する酵素HSD17B2の遺伝子をゲノムスクリニングで同定した。本年度は、本格的にa),b),c)の機能を解析した。前立腺がん培養細胞でアンドロゲン依存細胞(1)LNcaP,アンドロゲン非依存細胞(2)PC3、(3)DU145における発現を評価した。a)は(1)での発現は少なく、(2)前者で多く(3)後者では低かった。さらにb)では(1)、(2)、(3)の順に発現が高かった。c)は、(1)、(2)、(3)とも発現が低い。さらに、構造的な分析を行ったa)はHERV Iの感染により、CYP19のExon1をExonizationするので、前立腺がんゲノムで検証したところExon1の欠失していた例はなかった。b)はSINEの挿入によって発現の調節領域が付加されているので、この遺伝子内のSINEの欠失について検証したが認めなかった。さらに、c)はヒトERVであるMER67の挿入によって、Exon4が生じている。特にLTRの存在を、前立腺がんゲノムで検証したところ、LTR同士による相同再組換えによる欠失は認めなかった。本研究では、a),b),c)いずれも、ヒトERVの挿入によって、遺伝子が正常に機能できることが確認できたが、がんのマーカーとしての意義は少ない。研究課題/領域番号:20659248, 研究期間(年度):2008 – 2009出典：研究課題「ゲノム病としての前立腺がん-内因性レトロウイルスとアンドロゲン調節領域-」課題番号20659248（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-20659248/）を加工して作

前立腺癌転移の分子診断と未治療癌、再燃癌に対する治療効果増強に関する実験的研究

金沢大学医学部附属病院1) 前立腺癌細胞の血行性微小播種の分子診断前立腺癌細胞の分子マーカーとしてのPSAmRNAに対するPCRを行い,現在、患者のその後の臨床経過を詳細に観察している。2) ARやestrogen receptor(ER)の発現増強を指標としてのこれらの発現誘導とその機序解明4種類のヒト前立腺癌細胞株(LNCaP,PC-3,DU-145,TSUPr-l)に分化誘導作用を有する薬剤としてInterferon(IFN),5-azacytidine,all-trans retinoic acid(ATRA)を作用させ,細胞数と各種mRNAの発現についてRT-PCR法を用いて検討した.(1)IFNとATRAについては,増殖抑制効果は認められなかった.(2)5-azacytidineについてはすべての細胞株において濃度依存的に細胞増殖の抑制が認められた。3) 2)の結果より、これらの分化誘導作用が細胞周期や転写系におけるプロモー夕に関与が示唆された。細胞周期の制御を視点におき、癌抑制遺伝子であるp16のmRNAは,DU-145で強発現,LNCaPで弱発現を示したが,さらに、5-azacytidineの作用下では,本来発現のないTSUPr-1およびPC-3でも発現の誘導が観察され,これらの細胞株におけるpromoter regionの脱メチル化が示された.5-azacytidineの曝露すなわちヒト前立腺癌細胞株において各種癌抑制遺伝子の脱メチル化を通して細胞増殖抑制作用を示す可能性が示唆された.今後は,その他の細胞周期の制御に関わる遺伝子の発現を検討するとともに,増殖および分化の一つのマーカーとされるテロメラーゼ活性を測定し,増殖抑制機構の解明に尽力する予定である.1)Molecular evaluation of hematogenous micro-metastasis from prostatic cancerStatistically we have selected patients according to their clinical stage, these patient had been preserved data such as PSA values, PSA mRNA from peripheral blood cells in advance. We are supposed to evaluate the relations between PSA value and the PSA expression using RT PCR.Now we are observing the clinical course these patients.2)Induction of expression in androgen receptor (AR) and estrogen receptor (ER) for four prostatic cancer cell lines.In our study, we evaluated an induction of AR and ER in AR-negative prostatic cell line (PC3, DU-145, TSUPr-1) and AR-positive cell line (LNCap) exposing agents such as interferon (INF), 5-azacytidine, all-trans retinoic acid (ATRA) which have an activity of potential cell differentiation.(1)There are no effects suppressing cell proliferation any cell lines using INF and ATRA.On the other hand, there are some effect suppressing cell proliferation using 5-azacytidine in these four prostatic cancer cell lines every concentrations. This results suggested that this induction activity is depend on cell cycle or promoter of transcription mechanism.(2)A cell cycle point of view, this system is related to p16 which is known to cancer suppressor gene. The p16 mRNA express high in DU145, low in LNCap. Furthermore TSUPr-1 and PC-3 which never express p16 protein in themselves induce the expression of p16 using 5-azacytidine.This means that the promoter region of these four prostatic cell line is demethylated. This result shows sate possibility that suppression of cell proliferation result in hypcmethylation exposing 5-azacytidine to prostatic cancer cell lines Next step we plan to evaluate the expression of genes which are related to controlling cell cycle, to demonstrate the telomerase activity as one of markers as proliferation and cell differentiation.研究課題/領域番号:09671618, 研究期間(年度):1997 – 1998出典：研究課題「前立腺癌転移の分子診断と未治療癌、再燃癌に対する治療効果増強に関する実験的研究 」課題番号09671618（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-09671618/096716181998kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作

前立腺癌細胞におけるステロイド代謝及びレセプター間のクロストーグに関する研究

前立腺癌細胞株(LNCaP,PC-3,DU145)を用いたステロイド代謝について、各ステロイドを基質にした薄層クロマトグラフィーによる分析結果、副腎ステロイドが、とりわけDHEAがステロイドプールとして大きく関与していることを平成11年度に明らかにした。また、アンドロゲン依存性前立腺癌株においてアンドロステンジオンからDHEAにいたる経路が優位に代謝しており、非依存性癌ではその逆の代謝活性を認めた。これらの現象の一部はステロイド代謝系におけるグルクロン酸抱合及び硫酸抱合がホルモン依存性に関与している可能性を示唆した。その代謝酵素のひとつであるglucuronosyltransferaseの発現の相違について明らかにし、その関与の可能性を検証した。これらの現象を分子生物学的に検討した結果、前立腺癌細胞株LNCaPにおいてはグルクロン酸抱合を触媒するglucuronosyltransferaseが強く発現しており、PC3,DU145において少ないことを見出した。平成12年度は、LNCaPに対してglucuronosyltransferaseの選択的なanti-sense oligomaやアンチセンスDNAを作製導入し、その増殖活性が抑制されるかどうか検討した。anti-sense oligoma導入し前立腺癌細胞の増額やステロイド代謝について検討したが、有意差をみとめなかったが、アンチセンスDNA導入によって、増殖活性の増加を抑制することを証明した。したがって、in vitro系であるが前立腺癌におけるアンドロゲン依存性は、アンドロゲン除去機構の低下がみられた結果であると結論できたが、その機構について今後の課題となった。Adrenal androgens function as an androgen source within prostate and androgen target tissue. In this study, we compared the ability of three human prostatic cancer cell lines to metabolize the adrenal androgens, dehydroepiandrosterone (DHEA) and androstenedione in living cultured condition. Androgen-independent cell lines PC-3, DU145 and androgen-dependent cell line LNCaP were investigated. The effect of glucuronide and sulfate conjugates was also investigated. There is a strong tendency in PC-3 or DU145 to convert androstenedione to DHEA or DHEA-S reservoir. On the other hand, LNCaP is capable of converting DHEA into androstenedione and subsequently into dihydrotestosterone (DHT). Moreover, androgens were converted into a glucuronide conjugate in LNCaP, but not in PC-3 or DU145. As a result, the metabolism of the adrenal precursor shifted to androgen formation in LNCaP.This could be confirmed by means of reverse transcription-PCR of uridine diphospho-glucuronosyltransferase (UGT) 2B15. Kinetic properties of UGT activity in LNCaP revealed DHT to be a better substrate than testosterone for prostatic UGTs. In conclusion, our findings show that the adrenal precursor pool has the potential to contribute to the regulation of prostatic cells. Moreover, the presence of UGT activities in LNCaP may have a regulatory effect on the active androgen level in the intracellular environment.研究課題/領域番号:11671542, 研究期間(年度):1999-2000研究機関: 金沢大学医学部附属病院出典：「前立腺癌細胞におけるステロイド代謝及びレセプター間のクロストーグに関する研究」研究成果報告書　課題番号11671542(KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

精細管内微小環境モジュレーションによる抗癌化学療法後精子形成回復救済療法の確立

精子形成に関与する遺伝子や、抗ガン剤によって選択的に破壊される遺伝子情報を収集した結果、減数分裂に関与する遺伝子が候補遺伝子のひとつであることが明らかになった。減数分裂で最も重要な過程は相同染色体の正確な分配である。相同組み換えは、組み換えホットスポットと呼ばれる相同組み換えが起きやすい部位での一過的なDNA二本鎖切断(double strand breaks:DSB)によって開始されるとされる。DNA間の相同性の検索とその交叉反応において、中心的な役割を果たしているのが真核生物ではRad51やRad52,Rad54,Rad55,Rad57,DMC1,Rpa1などのタンパク質で群である。これらの遺伝子をノックアウトしたマウスでは、RAD51がDMC1の機能を相補できないことが報告され、DMC1の産物タンパクが相同染色体間の相同性のみを認識し対合させると考えられ、とくに減数分裂時に特異的な機能を持つ。本研究で明らかになったことは、DMC1(GenBank、NM_007068)の遺伝子産物についての検討である。DMC1は特発性不妊症患者で3つの転写物が存在することを明らかにし、これらの選択的スプライシングを受けた転写物が、精細胞系の制御を行っている。各選択的スプライシング産物であるイソフォームタンパクがモチーフやドメインが修飾された結果、精細胞のアポトーシスを誘導する可能性も考えられた。本遺伝子のスプライシングバリアントが減数分裂の制御に関与し、その結果精子形成能に影響を与えることを明らかにした。総括すると、精子形成不全のひとつの可能性として、DNA間の相補性を認識するという機構、すなわち相同染色体を認識の破綻により、減数分裂不全が生じ、精子形成不全が惹起される。DMC1はこれらの機構を説明できる、ひとつの候補遺伝子であることを明らかにした。As a result of having retrieving genetic information from NCBI, a gene which was damaged selectively due to the various anti-cancer agents has been selected. Moreover recovery-related proteins after treating using anti-cancer agents were also associated with the genes during expressing in the meiotic stage. These candidate genes contributed to spermatogenesis and were naive to various anti-cancer agents depended on their dose. Generally speaking, the most important process of meiotic stage is accurate distribution of homologous chromosomes. It is assumed that the homologous recombination between chromosomes occurred initially in a transient DNA double-strand break (DSB) in the beginning to meiotic stage. In the cross reaction between homologous strands, the proteins such as Rad51 or Rad52, Rad54, Rad55, Rad57, DMC1, Rpa1 play a central role in a eukaryote. Specially, it is reported that RAD51 has not replaced the function of DMC1 (GenBank, NM_007068) in meiotic stage according to the knockout mouse. The transcripts of DMC1 are particularly specific in meiotic stage and enable to recognize only homogenous strands.Our study revealed that the transcripts of DMC1 were existed three products derived from alternative splicing. Clinically these transcripts had a various number in the idiopathic male infertility. According to analyzing the clinical samples, it was suggested that the number of the isoforms leaded to modify a motif and domain of the DMC1, and was thought to be induced apoptosis of spermatid. These genetic splicing variants contributed to meiotic control and clarified to affect the possibility of the spermatogenesis. Our study showed that one mechanism of spermatogenesis arrests was associated with the dysfunction of early stage during meiosis due to isofoms derived from domain specific proteins.研究課題/領域番号:17591670, 研究期間(年度):2005-2006研究機関: 金沢大学大学院医学系研究科出典：「精細管内微小環境モジュレーションによる抗癌化学療法後精子形成回復救済療法の確立」研究成果報告書　課題番号17591670 (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)　　　本文データは著者版報告書より作

前立腺癌転移の分子診断と未治療癌、再燃癌に対する治療効果増強に関する実験的研究

1) 前立腺癌細胞の血行性微小播種の分子診断前立腺癌細胞の分子マーカーとしてのPSAmRNAに対するPCRを行い,現在、患者のその後の臨床経過を詳細に観察している。2) ARやestrogen receptor(ER)の発現増強を指標としてのこれらの発現誘導とその機序解明4種類のヒト前立腺癌細胞株(LNCaP,PC-3,DU-145,TSUPr-l)に分化誘導作用を有する薬剤としてInterferon(IFN),5-azacytidine,all-trans retinoic acid(ATRA)を作用させ,細胞数と各種mRNAの発現についてRT-PCR法を用いて検討した.(1)IFNとATRAについては,増殖抑制効果は認められなかった.(2)5-azacytidineについてはすべての細胞株において濃度依存的に細胞増殖の抑制が認められた。3) 2)の結果より、これらの分化誘導作用が細胞周期や転写系におけるプロモー夕に関与が示唆された。細胞周期の制御を視点におき、癌抑制遺伝子であるp16のmRNAは,DU-145で強発現,LNCaPで弱発現を示したが,さらに、5-azacytidineの作用下では,本来発現のないTSUPr-1およびPC-3でも発現の誘導が観察され,これらの細胞株におけるpromoter regionの脱メチル化が示された.5-azacytidineの曝露すなわちヒト前立腺癌細胞株において各種癌抑制遺伝子の脱メチル化を通して細胞増殖抑制作用を示す可能性が示唆された.今後は,その他の細胞周期の制御に関わる遺伝子の発現を検討するとともに,増殖および分化の一つのマーカーとされるテロメラーゼ活性を測定し,増殖抑制機構の解明に尽力する予定である.研究課題/領域番号:09671618, 研究期間(年度):1997-1998研究機関: 金沢大学医学部附属病

Male Infertility and Its Causes in Human

Infertility is one of the most serious social problems facing advanced nations. In general, approximate half of all cases of infertility are caused by factors related to the male partner. To date, various treatments have been developed for male infertility and are steadily producing results. However, there is no effective treatment for patients with nonobstructive azoospermia, in which there is an absence of mature sperm in the testes. Although evidence suggests that many patients with male infertility have a genetic predisposition to the condition, the cause has not been elucidated in the vast majority of cases. This paper discusses the environmental factors considered likely to be involved in male infertility and the genes that have been clearly shown to be involved in male infertility in humans, including our recent findings

Androgen and prostate cancer: the role of primary androgen deprivation therapy in localized prostate cancer

金沢大学医薬保健研究域医学系Background: The basic mechanisms and clinical efficacy of primary androgen deprivation therapy (PADT), especially combined androgen blockade (CAB) for localized or locally advanced prostate cancer (PCa) have been outlined. An important point relates to which patients are suitable candidates for PADT. Methods: A retrospective review of the efficacy of PADT in 628 patients with localized or locally advanced PCa treated with PADT at seven institutions in Japan was carried out. Results: It was found that more than 30% of low- or intermediate-risk localized PCa patients could have their disease controlled over the long-term by PADT alone. Short-term or intermittent PADT could not be recommended because of the possibility of character change in the cancer cells as a result of incomplete androgen ablation. Conclusion: Algorithms are proposed for the treatment of localized PCa not only in low- and intermediate-risk groups, but also in the high-risk group. Future research directions are indicated. © 2008 WPMH GmbH

Primary combined androgen blockade in localized disease and its mechanism

金沢大学医薬保健研究域医学系In spite of clinical practice guidelines such as NCI-PDQ - in which primary androgen deprivation therapy (PADT) is not recommended as the primary treatment for localized prostate cancer - many patients have been treated with PADT. One of the reasons is that urologists themselves permit patients\u27 desire because they know the effectiveness of PADT for some patients in their experiences. In this review we demonstrate basic mechanisms and the clinical efficacy of primary combined androgen blockade (PCAB) for localized or locally advanced prostate cancer. Then we discuss which patients are candidates for PCAB, and show that more than 30% of low- or intermediate-risk localized prostate cancers could be controlled in the long term with only PCAB. Short-term or intermittent PADT could not be recommended because of the possibilities of changing the character of the cancer cells by incomplete androgen ablation. We propose algorithms for the treatment of localized prostate cancer not only in low- and intermediate-risk groups but also in the high-risk group. © 2008