Etude structurale et fonctionnelle du facteur de transcription M2-1 du virus respiratoire syncytial

Le virus respiratoire syncytial (VRS) est le principal agent responsable de maladies respiratoires graves chez les jeunes enfants. Il n y a pas de vaccin pour l homme et le développement d antiviraux est nécessaire. Le génome du VRS est constitué d un ARN simple brin de polarité négative qui sert de matrice pour la transcription et la réplication des ANR viraux. L ARN polymérase virale est un complexe composé de protéines N, L, P, et M2-1 est capable de se lier à l ARN mais aussi d interagir avec la phosphoprotéine P. Ces propriétés de liaison sont liées à la région globulaire de M2-1 allant de la Sérine 58 à l Arginine 177. Nous avons déterminé la structure de ce domaine par résonance magnétique nucléaire (RMN). Le recouvrement partiel des surfaces d interaction pour l ARN et P sur M2-158-177 confirme les résultats obtenus préalablement concernant une compétition entre ces deux partenaires. Nous avons identifié huit résidus localisés sur ces surfaces critiques pour l activité transcriptionnelle du complexe polymérase. Des mutations simples suffisent à perturber spécifiquement soit l interaction avec P soit avec l ARN sur M2-1. Le recrutement de M2-1 dans le corps d inclusion cytoplasmiques, correspondant à des sites de synthèse de l ARN viral, est diminué par des mutations affectant uniquement l interaction avec P. Ces résultats révèlent que les interactions entre M2-1 et l ARN ou P peuvent être découplées bien qu elles soient essentielles pour la fonction d activateur de la transcription de M2-1.Respiratory Syncytial Virus (RSV) is the main cause of pneumonia and bronchiolitis in young children. There is no vaccine nor antiviral for humans. This virus encodes its own NA-dependent RNA polymerase (RdRp) to transcribe and replicate viral genes.The RdRp is composed of the nucleoprotein N, the phosphoprotein P, the large protein L and the transcription factor M2-1. Our aim is to characterize the structure and the function of the RdRp proteins to develop antiviral strategies. The M2-1 protein functions as an essential transcriptional cofactor of the RdRp complex by increasing polymerase processivity. M2-1 is a modular RNA binding protein that also interacts with the viral phosphoprotein P, another component of the RdRp complex. These binding properties are related to the core region of M2-1 encompassing residues S58 to K177.Here we report the NMR structure of the RSV M2-158-177 core domain. The partial overlap of RNA and P interaction surfaces on M2-158-177 rationalizes the previously observed competitive behavior of RNA versus P. we identified eight residues located on these surfaces that are critical for an efficient transcription activity of the RdRp complex. Single bodies, which are regarded as sites of viral RNA synthesis, was impared by mutations affecting only binding to P, but not to RNA, suggesting that M2-1 is associated to the hononucleocapsid by interacting with P.These results reveal that RNA and P binding to M2- can be uncoupled and that both are critical for the transcriptional activation function of M2-1.VERSAILLES-BU Sciences et IUT (786462101) / SudocSudocFranceF

Etude des interactions moléculaires au sein du complexe polymérase du virus respiratoire syncytial

Le virus respiratoire syncytitial (VRS) est le principal agent causal des bronchiolites chez le jeune veau et les enfants. Actuellement, il n existe ni vaccin, ni traitements anti-viraux efficaces permettant de lutter contre le VRSH. Ce virus enveloppé dont le génome est composé d une seule molécule d ARN de polarité négative, possède sa propre machinerie permettant de répliquer et transcrire: le complexe ARN-polymérase. Mon travail de thèse a consisté a cartographier et caractériser des domaines d interactions sur différentes protéines faisant partie du complexe ARN-polymérase du VRS. Celui-ci se compose de la nucléoprotéine (N), la phosphoprotéine (P), la polymérase (L pour large ) et le co-facteur de transcription M2-1. Ce sont des cibles potentielles pour le développement de drogues antivirales. J ai cartographié le domaine nécessaire et suffisant pour l interaction entre P et N sur P. Ceci m a permis d isoler de façon inattendue un complexe N-ARN structuré en anneaux. À partir de ces objets, j ai pu caractériser la taille des ARNs encapsidés par la nucléoprotéine et déterminer le nombre de bases en contact avec chaque monomère de N. Ce matériel a également été utilisé dans des essais de vaccination en collaboration. Des essais d expression de la grosse sous-unité de la polymérase du VRS n ont pas abouti. Enfin, l étude du facteur de transcription viral M2-1 nous a permis d identifier un domaine globulaire capable d interagir à la fois avec P, de l ARN ou de l ADN. J ai pu montrer que la région N-terminale est bien un zinc finger . De façon étonnante, celui-ci fixe la tubuline. Le rôle exact de cette interaction dans le cycle viral reste à déterminer.The respiratory syncytitial virus (RSV) is the main causal agent of bronchiolites at the young calf and the children. There is no antiviral treatment, nor vaccine against the RSV for the humain species for the moment. The genome of the RSV is a single negative stranded RNA molecule. The virus possesses its own machinery allowing to replicate and to transcribe: the RNA-polymerase complex. My phD work consisted in mapping and in characterizing domains of interactions on various proteins being a part of the RNA-polymerase complex of the RSV. This one consists of the nucleoproteine (N), the phosphoproteine (P), the polymerase (L for "large") and the co-factor of transcription M2-1. They are potential targets for the development of antiviral drugs.I mapped the necessary domain for the interaction between P and N on P protein. This allowed me to isolate in an unexpected way a complex N-RNA structured in rings. From these objects, I was able to characterize the size of the RNA encapsidated by the nucleoproteine and to determine the number of nucleotide contacts by monomer of N. This material was also used in vaccination trials in collaboration.The expression of the RSV polymerase L did not succeed. Finally, the study of the viral factor of transcription M2-1 allowed us to identify a globular domain interacting with P, the ARN or the DNA. I was able to show that the N-terminal region is indeed a zinc binding domain. In a surprising way, this one fixes the tubulin. The exact role of this interaction in the viral cycle remains to identify.VERSAILLES-BU Sciences et IUT (786462101) / SudocSudocFranceF

Targeting respiratory syncytial virus replication by antiviral molecules

International audienc

Targeting respiratory syncytial virus replication by antiviral molecules

International audienc