The DNA damage response in terminally differentiated skeletal myotubes

Tese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2017A integridade da informação genética constitui o fator mais importante do qual a vida depende. A molécula de DNA está constantemente exposta a diferentes tipos de lesões causadas por fontes endógenas, como espécies reativas de oxigénio provenientes do metabolismo, ou fontes exógenas derivadas de fatores mutagénicos, como a luz ultravioleta (UV), radiação ionizante (IR) ou agentes quimioterápico. Estima-se que diariamente as nossas células sofram mais de 100000 alterações espontâneas no DNA, 50 das quais quebras na dupla cadeia (DSB) de DNA. Independentemente da origem dos fatores mutagénicos eles podem conduzir a variadas alterações na molécula de DNA, tais como inserções, deleções, aductos, intra e intercadeia crosslink. Deste modo, a célula desenvolveu diferentes mecanismos para reparar diferentes tipos de lesões com o objetivo de manter a homeostasia, assegurar a viabilidade celular e promover a sobrevivência. Para que os mecanismos de reparação possam atuar, a célula tem de reconhecer e sinalizar a lesão. A resposta a lesões na molécula de DNA (DDR) é assim constituída pelo reconhecimentos, sinalização e reparação do DNA danificado. As modificações na cromatina representam um importante papel na DDR permitindo a sinalização das lesões, recrutando fatores de reparação e permitindo o acesso da maquinaria de reparação do local de lesão. Quando a molécula de DNA sofre uma DSB a célula pode adotar diferentes mecanismos para a reparar: reparação homóloga (HR) e a ligação das extremidades não homólogas (NHEJ). Contrariamente à via de HR que requer uma cadeia molde homóloga para restaurar a informação genética, a via de NHEJ conduz à ligação direta das extremidades de DNA da DSB, propiciando deste modo o erro. Em reposta a lesões na molécula de DNA, os dois primeiros grupos de proteínas a serem recrutados para o local de lesão serão o complexo Mre11- Rad50-NBS1 (MRN) e a família PIKK (phosphatidylinositol 3-kinase related protein kinase) onde se inclui ATM (ataxia-telangiectasia mutated).O complexo MRN reconhece rapidamente o local da lesão e acumula-se nesse local, recrutando ATM que se autofosforila, permitindo a consequente fosforilação da variante de histona H2AX (γH2AX). Esta marca espalha-se por toda a região circundante promovendo a ligação de outros fatores de reparação como o MDC1. BRCA1 (breast cancer susceptibility protein 1) e 53BP1 (p53 binding protein 1) são também recrutados para o local funcionando como mediadores e impulsionadores da sinalização. O fator 53BP1 tem grande importância na determinação da via de reparação a ser adotada, favorecendo desta forma a via NHEJ. A par destes mecanismos para sinalizar e reparar as lesões na molécula de DNA, a ativação do controlo do ciclo celular é absolutamente essencial para retardar o ciclo celular e providenciar tempo para que a reparação tenha lugar, de modo a impedir que as lesões e consequentes mutações sejam transmitidas às gerações seguintes. No centro desta regulação encontram-se as quinases dependentes de ciclinas (CDK) e as ciclinas. A variação dos níveis de ciclinas por ubiquitinação e degradação no proteassoma ao longo do ciclo celular permite a manutenção das diferentes fases do ciclo celular. A ativação de p53 via Chk2 culmina na ativação de p21, um potente inibidor dos complexos ciclina-CDK, resultando na paragem do ciclo celular. A reparação as lesões na molécula de DNA em células proliferativas é então mais eficiente por estar disponível o cromatídeo irmão como molde para HR. Tendo em consideração que as células terminalmente diferenciadas podem viver décadas, é então crucial que possuam mecanismos de reparação competentes de modo a prevenir o envelhecimento e a doença. Contudo, muito pouco é conhecido sobre o modo como células pós mitóticas, como os neurónios e miofibras musculares, reparam DSB e ainda qual o papel do ciclo celular e das suas transições em resposta a lesões no DNA em miofibras musculares. Deste modo hipotetizámos que as células musculares terminalmente diferenciadas poderiam reentrar transientemente no ciclo celular em resposta a lesões, com previamente descrito para os neurónios. Com o objetivo principal de entender os eventos moleculares que têm lugar nos processos de reparação do DNA lesado em células de músculo esquelético e entender as vias de reparação que conduzem à efetiva reparação destas lesões, caracterizámos as principais proteínas ativadas em resposta às lesões induzidas e investigámos a existência de eventuais transições do ciclo celular que acompanham a reparação do DNA em miotubos, células diferenciadas percursoras de miofibras. Após a otimização do processo de diferenciação de mioblastos em miotubos, caracterizámos alguns fatores de sinalização envolvidos na DDR. Observámos que, em consequência de da indução de lesões com o radiomimético neocarzinostatina (NCS), a variante de histona H2AX é fosforilada em mioblastos e em miotubos, embora possamos concluir que nos miotubos os seus níveis basais, na ausência de tratamentos com NCS, são mais elevados, evidenciando deste modo uma maior quantidade de lesões endógenas. É ainda evidente que existe reparação das lesões induzidas uma vez que os níveis de γH2AX são repostos para os valores iniciais nos mioblastos e nos miotubos. Observámos também que em resposta às lesões existe uma eficiente ativação de ATM e 53BP1, embora esta seja mais exacerbada e prolongada, para ambas as proteínas, nos miotubos. É ainda observável uma ativação de p21 em resposta às lesões induzidas o que demonstra a ativação do controlo do ciclo celular. Por forma a avaliar o papel de ATM na fosforilação de H2AX e na ativação de p53/p21, avaliámos a cinética de γH2AX e p53/p21em resposta à indução de lesões com NCS em miotubos após inibição de ATM. Observámos que os níveis de γH2AX. p53 e p21 em resposta a lesões no DNA são significativamente inferiores nas células tratadas com o inibidor de ATM comparativamente com as condição controlo na ausência de inibidor. Este resultado sugere que a DDR em miotubos é dependente de ATM. A avaliação de formação de foci de RAD51 em resposta a lesões no DNA foi conclusiva quanto à incapacidade dos miotubos realizarem a via de HR canónica uma vez que não foi detetado foci de RAD51 em miotubos após indução de lesões. A avaliação das transições do ciclo celular com recurso ao sistema FUCCI (fluorescence ubiquitination cell cycle indicator) indiciou que os miotubos não apresentam transições no ciclo celular em resposta a danos no DNA. O estudo da dinâmica de replicação, através da incorporação de EdU, após indução de lesão também evidenciou que não há replicação de DNA após tratamento com NCS, nem nos mioblastos nem nos miotubos. Deste modo é evidente que os miotubos não apresentam transições no ciclo celular em resposta a danos no DNA e que a dinâmica de resposta e reparação, bem como as proteínas envolvidas é distinta dos seus progenitores, apontando para que os miotubos não reparem DSB pela via canónica de HR, mas sim pela via NHEJ. Estando descrito que os miotubos são mais resistentes à apoptose do que os seus progenitores, é conclusivo que estas células têm eficientes mecanismos para reparar ou sucumbir as lesões na molécula de DNA. Com o objetivo de avaliar dinâmica da cromatina durante a reparação do DNA, lesámos um único núcleo num miotubos multinucleado com recurso a radiação laser UV-A e avaliámos morfologicamente as alterações na cromatina. Denotámos, pela análise da redistribuição da histona H2B, que existe uma modulação da arquitetura da cromatina no núcleo lesado em comparação com os núcleos não lesados – condensação da cromatina em resposta a lesão extensa num único núcleo. Hipotetizámos deste modo que a modulação observada poderá ser consequência de um mecanismo de inativação/silenciamento da cromatina no núcleo danificado de modo a não comprometer a sobrevivência de toda a célula e prevenir a transcrição de genes aberrantes. Preliminarmente, a imunofluorescência para deteção da marca epigenética H3K36me3 permitiu constatar uma diminuição dos níveis desta marca no núcleo lesado em comparação com os núcleos não lesados na mesma célula, sugerindo uma diminuição na quantidade de genes transcripcionalmente ativos. Contudo, e como referido anteriormente, trata-se de um resultados preliminar que pretendemos comprovar brevemente. Adicionalmente, pretendemos testar outras marcas epigenéticas descritas como características de cromatina ativa e inativa de modo a comprovar a nossa hipótese. Todos os resultados obtidos demonstram que ambos os mioblastos e os miotubos são capazes de corretamente sinalizar e ativar a DRR. A ausência de foci de RAD51 em resposta às lesões induzidas permite excluir a hipótese de que os miotubos são capazes de utilizar a via canónica de HR para reparar DSB, enquanto a sua presença nos mioblastos indica o contrário. Os ensaios realizados para avaliar as transições no ciclo celular revelaram que os miotubos não sofrem alteração no ciclo celular e não replicam o seu DNA como mecanismo para reparar eficientemente as lesões. A ativação de p21 em resposta a lesões no DNA sugere a ativação do controlo do ciclo celular, contudo o seu papel nos miotubos tem de ser clarificado. As modificações na cromatina observadas após lesão no DNA com irradiação laser UV-A sugerem uma inativação metabólica do DNA lesado como parte de um mecanismo para inativar excessivas lesões num único núcleo sem comprometer a sobrevivência celular. Esta hipótese será futuramente testada.The DNA damage response and the effective pathways used to repair DNA lesions have been largely studied in proliferating cells. However, less is known on how differentiated cells, like myotubes, can accurately and efficiently repair severe DNA lesions like double-strand breaks (DSB) and what role can cell cycle transitions have in this field. Our results show that differentiated myotubes cannot repair DNA DSB by the canonical homologous recombination (HR) pathway. In fact, we did not find any evidence of cell cycle re-entry upon inducing DNA lesions. Moreover, we found that, upon DNA damage of one single nucleus, myotubes do not commit to apoptosis. Instead, we observed a rearrangement of the architectural features of chromatin, which is an important aspect of the DNA damage signalling and repair. Namely, we found that DNA damage triggers a chromatin condensation state that is suggestive of a global transcriptional shut-off. Our data suggest that selective inactivation of one single nucleus with damaged DNA is part of the DNA repair toolbox of multinucleated cells. With this new tool, myotubes could prevent the transcription of aberrant genes while avoiding apoptosis to maintain cell viability