Interaktion orthosterisch/allosterischer Antagonist-Hybride mit muskarinischen M₂-Acetylcholinrezeptoren

Muskarinische Acetylcholinrezeptoren gehören zur Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Sie verfügen über zwei räumlich benachbarte Bindungsstellen. Die orthosterische Acetylcholinbindungsstelle befindet sich zwischen den transmembranären Domänen und ist unter den fünf bekannten Subtypen (M1-M5) hoch konserviert. Das allosterische Haftareal ist auf der extrazellulären Seite des Rezeptors im Eingangsbereich zur orthosterischen Tasche lokalisiert. Die Aminosäuresequenz in diesem Bereich variiert zwischen den Subtypen. Hybridliganden aus dem muskarinischen orthosterischen Agonisten Iperoxo und einem allosterischen M2-selektiven Modulatorbaustein wiesen in vorangegangenen Untersuchungen eine M2-selektive Rezeptoraktivierung auf. Eine überlappende Bindung an die orthosterische und an die allosterische Bindungsstellen konnte mit Hilfe verschiedener experimenteller Ansätze gezeigt werden. Dieser ortho-/allosterische Bindungsmodus wurde dualsterisch genannt (Antony et al., FASEB J 2009, (23): 1-9). In der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, ob das Konzept der dualsterischen Rezeptorbesetzung auf Antagonisten übertragbar ist. Zu diesem Zweck wurden im Arbeitskreis von Frau Prof. Dr. U. Holzgrabe (Pharmazeutisches Institut, Universität Würzburg) neuartige Hybridliganden synthetisiert, bei denen der orthosterische Agonist-Baustein der dualsterischen Liganden gegen einen der beiden unselektiven inversen Agonisten Atropin (8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]oct-3-yl)-3-hydroxy-2-phenylpropanoat) oder Scopolamin ((–)-(S)-3-hydroxy-2-phenylpropionicacid(1R,2R,4S,7S,9S)-9-methyl-3-oxa-9-azatricyclo[3.3.1.02,4]non-7-yl-ester) ausgetauscht ist. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rezeptorinteraktion dieser neuen Verbindungen in Bezug auf Subtypselektivität, Bindungs-topographie, Bindungskinetik und intrinsische Aktivität charakterisiert. Für die Untersuchung der Subtypselektivität der Hybridliganden wurden Radioligand-bindungsstudien mit dem orthosterischen Radioantagonisten [3H]N-Methylscopolamin ([3H]NMS) an Membransuspensionen aus stabil transfizierten humanen M2- und M5-Rezeptoren durchgeführt. Im Fall der atropinhaltigen Hybridliganden Atr-W84 (N-[(1,3-dioxo-isoindol-2-yl)-propyl]-6-[3-(3-hydroxy-2-phenylpropoxy)-8-methyl-8-azoniabicyclo-[3.2.1]oct-8-yl]-N,N-dimethyl-hexane-1-aminium dibromide) und Atr-Naph (N-[3-(benzo-[de]isoquinolin-2-yl)-2,2-dimethylpropyl]-6-[3-(3-hydroxy-2-phenylpropoxy)-8-methyl-8-azoniabicyclo[3.2.1]oct-8-yl]-N,N-dimethyl-hexane-1-aminium dibromide) zeigte sich eine M2-Prävalenz, nicht jedoch bei den Scopolamin-Analoga. Im allosterischen Teil systematisch modifizierte Substanzreihen, die von den orthosterischen Antagonisten Atropin und Scopolamin als auch vom orthosterischen Agonisten Iperoxo ausgingen, ergaben parallele Strukturwirkungsbeziehungen für die Bindungsaffinität am M2-Rezeptor. Somit kann geschlossen werden, dass der Bindungsmodus der Hybridantagonisten im Prinzip ebenso dualsterisch ist wie von Antony et al. (2009) für die Hybridagonisten nachgewiesen. In Versuchen mit punktmutierten M2-Rezeptoren zeigten die Atropin-Hybride Atr-W84 und Atr-Naph einen Affinitätsabfall sowohl an der orthosterischen Mutation M2104Tyr→Ala als auch an den beiden allosterischen Mutationen M2177Thr→Gln und M2422Trp→Ala. Diese Befunde stützen die Hypothese eines dualsterischen Bindungsmodus der Hybridantagonisten. Die Scopolamin-Hybride wiesen nur einen Affinitätsverlust an der orthosterischen Mutante auf. Dies ist im Einklang mit der fehlenden M2/M2-Subtyp-Selektivität der Scopolamin-Hybride. Die funktionellen Untersuchungen wurden mit Atr-Naph durchgeführt, da diese Verbindung die deutlichsten Hinweise auf einen dualsterischen Bindungsmodus aufwies. Im [35S]GTPγS-Experiment an Membransuspensionen aus stabil transfizierten CHO-hM2-Zellen verhielt sich die Substanz als inverser Agonist, indem es die spontane Aktivität des Rezeptors zu reduzieren vermochte. Dies war erwartet worden, da die beiden Bausteine des Hybrids, Atropin und Naphmethonium [2-[3-[1-[6-[1,1-Dimethyl-1-[3-(1,3-dioxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl-)propyl]ammonium]hexyl]-1,1-dimethylammonium]-2,2-dimethylpropyl]benzo[de]-isoquinolin-1,3-dion], jeweils inverse Agonisten darstellen. Messungen der dynamischen Massenumverteilung an lebenden CHO-hM2-Zellen zeigten einen raschen Eintritt der antagonistischen Wirkung des Hybrids Atr-Naph gegenüber Acetylcholin, der dem seiner Bausteine Atropin und Naphmethonium entsprach. Dies ist bemerkenswert, weil die Bindungskinetik orthosterischer Liganden an muskarinischen Rezeptoren durch allosterische Modulatoren charakteristischerweise verzögert wird. Zusammengefasst stützen die Befunde die Hypothese, dass auch am inaktiven Muskarin-M2-Rezeptor eine dualsterische Bindung möglich ist. Zukünftige Untersuchungen werden klären müssen, ob es möglich ist, durch geeignete Strukturvariationen eine stärkere Subtypselektivität dualsterischer Antagonisten zu erreichen

Applying label-free dynamic mass redistribution technology to frame signaling of G protein–coupled receptors noninvasively in living cells

Label-free dynamic mass redistribution (DMR) is a cutting-edge assay technology that enables real-time detection of integrated cellular responses in living cells. It relies on detection of refractive index alterations on biosensor-coated microplates that originate from stimulus-induced changes in the total biomass proximal to the sensor surface. Here we describe a detailed protocol to apply DMR technology to frame functional behavior of G protein-coupled receptors that are traditionally examined with end point assays on the basis of detection of individual second messengers, such as cAMP, Ca<sup>2+</sup> or inositol phosphates. The method can be readily adapted across diverse cellular backgrounds (adherent or suspension), including primary human cells. Real-time recordings can be performed in 384-well microtiter plates and be completed in 2 h, or they can be extended to several hours depending on the biological question to be addressed. The entire procedure, including cell harvesting and DMR detection, takes 1-2