[Evaluatie en validatie van een een-punts-verdunning werkzaamheidstest gebaseerd op de serologie van difterie toxoid bevattende vaccins: consistentie in produktie en kwaliteitscontrole op het Laboratorium Controle Biologische Producten van het RIVM.]

A single-dilution assay can be a valid procedure to demonstrate that a product exceeds the minimal requirement given for potency provided that consistency in production and testing has been proven. Information is presented justifying the use of a single dilution assay based upon quantitative responses for establishing the potency of diphtheria toxoid vaccines. Data of 27 multi-dilution assays on the diphtheria toxoid component of DPT-polio vaccines were retrospectively analysed for consistency in production and testing. Criteria for analysis are given and a protocol for quality assurance of a single dilution assay based upon serology is discussed.VH

Research of the possibilities to use in vitro antibody production by immune cells for the control of diphtheria and tetanus containing vaccines

This report describes the possible use of an in vitro culture system for the production of antibodies, as testsystem for the control of diphtheria and tetanus containing vaccines like DPTP (Diphtheria, Pertussis, Tetanus and Polio) and DTP (Diphtheria, Tetanus and Polio). Both in a human and rabbit testsystem an increase was found in the number of antibody secreting cells, after incubation of PBL's (peripheral blood lymphocytes) of immunized donors with DPTP or DTP vaccine. In both test systems antibodies against diphtheria and tetanus were observed. The antibody production in the human system, however was based on a false positive assay. The antibodies, added to initiate antibody production in the immune cells, were passively transferred from the stimulation phase of the assay day 1 to day 4, to the production phase of the assay day 5 to day 12. The passive transfer was caused by the presence of the insoluble aluminium phosphate used as adjuvant in the vaccines. Both for diphtheria and tetanus antigen specific antibody production was observed in the rabbit culture system. For the tetanus antigen clearly a dose response relationship was present, which was not found for the diphtheria antigen. It was technically not possble to obtain a reproducible harvest of the rabbit PBL's, which limits the possibilities of this system for vaccine control. Conclusively we can say that the control of diphtheria and tetanus vaccine by means of in vitro antibody production is not (yet) possible. Further research is needed to optimize and standardize the in vitro testsystems before they can be used for routine vaccine control.VH

Evaluatie van Whole Cell-vaccin geinduceerde humorale antilichaamresponsen in de Pertussis Serological Potency Test in relatie met de Muisbeschermingstest

De Pertussis Serologische Potency Test (PSPT) is ontwikkeld als een alternatief voor de huidige Muisbeschermingstest (MBT). De PSPT is gebaseerd op het in vitro bepalen van de humorale afweerrespons tegen het hele scala aan oppervlakte antigenen van B.pertussis bacterie in muizen na immunisatie met kinkhoest whole cell vaccins (WCV). Kinkhoest-antilichaamconcentraties in muizensera wordt bepaald met behulp van de 18323-whole cell ELISA (18323-WCE). Tijdens een 'in-house' validatie studie zijn 13 kinkhoest WCV's in zowel de PSPT als de MBT getest. De overeenkomst van beide testen is aangetoond m.b.v. een chi-kwadraat test ; de werkzaamheid van WCV's in beide testen zijn niet significant verschillend (p = 0.95). Vergeleken met de MBT is de PSPT beter reproduceerbaar, hetgeen tot uiting komt in de kleinere 95% betrouwbaarheidsintervallen. Aanvullend hierop is de immunogeniteit van WCV's in antigeen-specifieke ELISA's en in vitro functionele testsystemen bestudeerd. De schatting van WCV-werkzaamheid op basis van de antilichaam responsen tegen Pertussis Toxine (PT), Filamentous Heam-aggltinine (FHA) of 69-kDa Outer Membrane Protein (OMP) was niet mogelijk door dat deze te laag en niet dosis afhankelijk waren. De antilichaam respons tegen het 92-kDa OMP correleerde niet met de overleving van muizen in de MBT, door te grote fluctuaties. De bescherming van muizen tegen een letale intracerebrale challenge is niet gerelateerd aan de humorale antilichaam respons tegen een specifiek antigeen, noch beperkt tot een afweermechanisme, maar lijkt overeen te komen met een synergistische effect van de humorale afweer respons tegen diverse zogenaamde 'beschermende' en 'niet-beschermende' antigenen. De PSPT is daarom een goed alternatief voor de MBT en geeft bovendien meer en betere informatie over de immunogeniteit, werkzaamheid en consistentie in productie van kinkhoest WCV's.The Pertussis Serological Potency Test (PSPT) has been developed as an alternative for the current MPT. The PSPT is based on in vitro assessment of the humoral immune response against the whole range of surface-antigens of B. pertussis in mice after immunisation with Whole Cell Vaccine (WCV). The concentration of pertussis antibodies in sera is measured in the 18323-Whole Cell ELISA (18323-WCE). In an in-house validation study 13 WCVs were tested in the PSPT and the MPT. Homogeneity of both test systems was proven by means of a modified chi-square test ; potencies were not significantly different (p = 0.95). Compared to the MPT, the PSPT is more reproducible as is indicated by its smaller 95% confidence intervals. Additionally, the immunogenicity of WCVs has been studied in antigen specific ELISAs and in vitro functional test systems to assess correlation with mouse protection. Estimation of WCV-potencies based on the antibody concentration against Pertussis Toxin (PT), Filamentous-Hemagglutinin (FHA) or 69-kDa Outer Membrane Protein (OMP) was not possible due to very low antibody responses which were not vaccine dose dependent. The anti-92-kDa OMP antibody response showed a poor correlation with the MPT, due to scattering. In conclusion, the protection of mice against a lethal intracerebral challenge is not related to a humoral immune response against a single 'protective' antigen, nor restricted to a single immune mechanism, but may be related to a synergistic effect of humoral responses against a wide range of 'protective' and 'non-protective' antigens. The PSPT is therefore a good alternative for the MPT and provides more precise information about immunogenicity, potency and hence on consistency in production of pertussis WCVs.V

Evaluatie van Whole Cell-vaccin geinduceerde humorale antilichaamresponsen in de Pertussis Serological Potency Test in relatie met de Muisbeschermingstest

The Pertussis Serological Potency Test (PSPT) has been developed as an alternative for the current MPT. The PSPT is based on in vitro assessment of the humoral immune response against the whole range of surface-antigens of B. pertussis in mice after immunisation with Whole Cell Vaccine (WCV). The concentration of pertussis antibodies in sera is measured in the 18323-Whole Cell ELISA (18323-WCE). In an in-house validation study 13 WCVs were tested in the PSPT and the MPT. Homogeneity of both test systems was proven by means of a modified chi-square test ; potencies were not significantly different (p = 0.95). Compared to the MPT, the PSPT is more reproducible as is indicated by its smaller 95% confidence intervals. Additionally, the immunogenicity of WCVs has been studied in antigen specific ELISAs and in vitro functional test systems to assess correlation with mouse protection. Estimation of WCV-potencies based on the antibody concentration against Pertussis Toxin (PT), Filamentous-Hemagglutinin (FHA) or 69-kDa Outer Membrane Protein (OMP) was not possible due to very low antibody responses which were not vaccine dose dependent. The anti-92-kDa OMP antibody response showed a poor correlation with the MPT, due to scattering. In conclusion, the protection of mice against a lethal intracerebral challenge is not related to a humoral immune response against a single 'protective' antigen, nor restricted to a single immune mechanism, but may be related to a synergistic effect of humoral responses against a wide range of 'protective' and 'non-protective' antigens. The PSPT is therefore a good alternative for the MPT and provides more precise information about immunogenicity, potency and hence on consistency in production of pertussis WCVs.De Pertussis Serologische Potency Test (PSPT) is ontwikkeld als een alternatief voor de huidige Muisbeschermingstest (MBT). De PSPT is gebaseerd op het in vitro bepalen van de humorale afweerrespons tegen het hele scala aan oppervlakte antigenen van B.pertussis bacterie in muizen na immunisatie met kinkhoest whole cell vaccins (WCV). Kinkhoest-antilichaamconcentraties in muizensera wordt bepaald met behulp van de 18323-whole cell ELISA (18323-WCE). Tijdens een 'in-house' validatie studie zijn 13 kinkhoest WCV's in zowel de PSPT als de MBT getest. De overeenkomst van beide testen is aangetoond m.b.v. een chi-kwadraat test ; de werkzaamheid van WCV's in beide testen zijn niet significant verschillend (p = 0.95). Vergeleken met de MBT is de PSPT beter reproduceerbaar, hetgeen tot uiting komt in de kleinere 95% betrouwbaarheidsintervallen. Aanvullend hierop is de immunogeniteit van WCV's in antigeen-specifieke ELISA's en in vitro functionele testsystemen bestudeerd. De schatting van WCV-werkzaamheid op basis van de antilichaam responsen tegen Pertussis Toxine (PT), Filamentous Heam-aggltinine (FHA) of 69-kDa Outer Membrane Protein (OMP) was niet mogelijk door dat deze te laag en niet dosis afhankelijk waren. De antilichaam respons tegen het 92-kDa OMP correleerde niet met de overleving van muizen in de MBT, door te grote fluctuaties. De bescherming van muizen tegen een letale intracerebrale challenge is niet gerelateerd aan de humorale antilichaam respons tegen een specifiek antigeen, noch beperkt tot een afweermechanisme, maar lijkt overeen te komen met een synergistische effect van de humorale afweer respons tegen diverse zogenaamde 'beschermende' en 'niet-beschermende' antigenen. De PSPT is daarom een goed alternatief voor de MBT en geeft bovendien meer en betere informatie over de immunogeniteit, werkzaamheid en consistentie in productie van kinkhoest WCV's

Internationale studie naar testsystemen voor het bepalen van de toxiciteit in whole-cell pertussis vaccin

Bij veertien laboratoria in dertien landen heeft een "collaborative study" plaatsgevonden om de relevantie van 5 testsystemen voor de controle op de toxiciteit van whole-cell kinkhoest vaccin in muizen te onderzoeken. Daarvoor werden 6 produkten, die verschillen in toxiciteit en werkzaamheid, getest. De studie omvat de volgende testsystemen: de Mouse Weight Gain (MWG) proef, dat is de huidige officieel verplichte proef ter controle van toxiciteit van kinkhoest en vier specifieke testsystemen ; de Leukocytose Promoting Factor (LPF) test, de Histamine Sensitizing Factor (HSF) test en de Chinese Hamster Ovary (CHO) test om pertussis toxine (PT) waarden te bepalen en de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) test om endotoxine waarden te meten. Tevens werd aan de deelnemers gevraagd om de werkzaamheid van de produkten te bepalen door de Mouse Potency (MP) test, volgens Kendrick. De MWG test bleek in bijna alle deelnemende laboratoria niet gevoelig genoeg om de totale toxiciteit van whole-cell pertussis te meten. Bovendien werden er regelmatig tussen de laboratoria statistisch significante verschillen aangetoond. De specifieke toxiciteitstesten (LPF, HSF, CHO en LAL test) bleken duidelijk nauwkeuriger, maar tussen de laboratoria werd voor de LPF test, CHO test en LAL test grote variatie aangetoond, statistisch significant bij p<0.05. Significante variatie in onderzoeks- resultaten kwamen eveneens bij MP test voor. Bovendien was het vermogen van de MP test om onderscheid te kunnen maken tussen produkten met hoge en lage werkzaamheid klein. De conclusie is, dat onder de voorwaarde van verfijning en vergaande standaardisatie, de HSF en CHO test en in het bijzonder de LPF test een meer geschikte test is om biologisch actief PT te bepalen dan de MWG test. Om het PT gehalte te bepalen werd een inhibitie ELISA gebruikt Deze test kan voor pre-screening doeleinden van belang zijn. De LAL test zou gebruikt moeten worden om de endotoxine activiteit te meten. De betekenis van de MP test, als model om de werkzaamheid te bepalen, wordt ter discussie gesteld.A collaborative study has been carried out to establish the precision and accuracy of 5 test systems for the assessment of the toxicity of whole cell pertussis vaccine in laboratory animals. To this end 6 vaccines, both including 'normal' and 'abnormal' products with respect to levels of Pertussis toxin and/or potency were tested. The study included the Mouse Weight Gain (MWG) test ; the current WHO-recommended bioassay to evaluate overall pertussis toxicity and four specific test systems ; the Leukocytosis Promoting Factor (LPF) test, the Histamine Sensitizing Factor (HSF) test, and the Chinese Hamster Ovary (CHO) clustering test to estimate pertussis toxine (PT) levels and the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) test to evaluate endotoxin levels. In addition participants were also asked to estimate potency by the Mouse Protection test according to Kendrick (MP). Fourteen laboratories in various countries participated in the study. In almost all participating laboratories MWG test was not very accurate in evaluating the overall toxicity of whole cell pertussis vaccines. In addition, statistical significant interlaboratory variation was frequently seen. The specific toxicity tests (LPF, HSF, CHO and LAL test) appeared to be more accurate, but large interlaboratory variation was seen, statistically significant at p<0.05 for LPF test, CHO test and LAL test. Significant variation in test results also occurred in the potency test. In addition, the discriminative power of the MP test between potent and non-potent products was low. It is concluded that, on the condition of optimization and stringent standardization, HSF and CHO test and in particular LPF test might be more appropriate to assess PT activity than the MWG test. An inhibition ELISA has been used to estimate levels of PT. This test could be of value for prescreening purposes. The LAL test should be used to estimate endotoxin activity. The value of the MP test, as a model to assess potency, is disputed.RIV