Die pathophysiologische Rolle der Infektion von sinusoidalen Endothelzellen der Leber mit murinem Zytomegalievirus

Zytomegalieviren wie humanes Zytomegalievirus (HCMV) und murines Zytomegalievirus (MCMV) sind DNA-Viren, die nach Primärinfektion lebenslang im infizierten Wirtsorganismus in einem latenten Zustand verbleiben können. In etwa 50-70% der Bevölkerung weltweit sind seropositiv für HCMV. Klinisch verläuft die Infektion mit HCMV für gewöhnlich asymptomatisch, vorausgesetzt der infizierte Wirt weist ein intaktes Immunsystem auf. Zytomegalieviren haben zahlreiche aktive Mechanismen entwickelt, um der drohenden Immunantwort des infizierten Wirtsorganismus zu entgehen. Die Manipulation der MHC-Klasse-I Antigenpräsentation stellt nur ein Beispiel der unzähligen viralen Evasionsmechanismen von Zytomegalieviren dar, um während einer antiviralen Immunantwort unerkannt zu bleiben. Außerdem besitzten Zytomegalieviren einen natürlichen Tropismus für Endothelzellen. Die Leber favorisiert eher Toleranz als Immunität. Unter den hepatischen Zellpopulationen, die für die Induktion von Immuntoleranz in Frage kommen, konnten sinusoidalen Endothelzellen der Leber (LSEC) als sessile antigenpräsentierende Zellen (APC) identifiziert werden. LSEC sind in der Lage, systemische antigenspezifische Immuntoleranz in CD8+-T-Zellen zu induzieren. Im Zuge der Dissertation sollte nun untersucht werden, welche physiologische Rolle eine Infektion von LSEC mit murinem Zytomegalievirus (MCMV) spielt und welche Konsequenzen sie nach sich zieht. Die Analyse der Infektion von LSEC mit MCMV hat gezeigt, dass LSEC permissiv für eine Infektion mit MCMV sind. Die Infektion von LSEC mit MCMV verläuft nicht-produktiv. LSEC sind in der Lage, Virionen effizient aufzunehmen. Dabei hat sich herausgestellt, dass an LSEC gebundenes Virus weiterhin infektiös bleibt und permissive Zielzellen effizient in trans infizieren kann. Diese Beobachtung spricht für eine Funktion infizierter LSEC als zentrale virale Propagationsplattform innerhalb des Wirtsorganismus. Durch die Analyse der immunologisch relevanten Oberflächenmoleküle infizierter LSEC konnte beobachtet werden, dass LSEC durch eine Infektion mit MCMV keiner phänotypischen Veränderung ausgesetzt sind. Außerdem konnte nach Infektion von LSEC mit MCMV keine Beeinträchtigung in der Aufnahme exogener Antigene festgestellt werden. Die Präsentation exogener, als auch endogener viral kodierter Antigene führt zu Immuntoleranz in CD8+-T-Zellen in vitro. Die aktiven Mechanismen viraler Immunevasion scheinen bei LSEC im Gegensatz zu dendritischen Zellen (DC) nicht zu greifen. Die funktionelle Analyse infizierter LSEC in einem Pilotexperiment lieferte zudem einen deutlichen Hinweis darauf, dass LSEC eine wichtige physiologische Rolle in der Induktion von CD8+-T-Zelltoleranz gegenüber viral kodierten Antigenen in vivo spielen. Die Daten legen den Schluss nahe, dass die Infektion tolerogener LSEC mit MCMV einen neuartigen passiven viralen Immunevasions -mechanismus beschreibt. LSEC nehmen dabei eine Brückenfunktion wahr, indem sie den Übergang von früher zu später Phase der Infektion mit MCMV sicherstellen

Modulation of NKp30- and NKp46-Mediated Natural Killer Cell Responses by Poxviral Hemagglutinin

Natural killer (NK) cells are an important element in the immune defense against the orthopox family members vaccinia virus (VV) and ectromelia virus (ECTV). NK cells are regulated through inhibitory and activating signaling receptors, the latter involving NKG2D and the natural cytotoxicity receptors (NCR), NKp46, NKp44 and NKp30. Here we report that VV infection results in an upregulation of ligand structures for NKp30 and NKp46 on infected cells, whereas the binding of NKp44 and NKG2D was not significantly affected. Likewise, infection with ectromelia virus (ECTV), the mousepox agent, enhanced binding of NKp30 and, to a lesser extent, NKp46. The hemagglutinin (HA) molecules from VV and ECTV, which are known virulence factors, were identified as novel ligands for NKp30 and NKp46. Using NK cells with selectively silenced NCR expression and NCR-CD3ζ reporter cells, we observed that HA present on the surface of VV-infected cells, or in the form of recombinant soluble protein, was able to block NKp30-triggered activation, whereas it stimulated the activation through NKp46. The net effect of this complex influence on NK cell activity resulted in a decreased NK lysis susceptibility of infected cells at late time points of VV infection when HA was expression was pronounced. We conclude that poxviral HA represents a conserved ligand of NCR, exerting a novel immune escape mechanism through its blocking effect on NKp30-mediated activation at a late stage of infection

Conditional gene expression systems in the transgenic rat brain

Abstract Background Turning gene expression on and off at will is one of the most powerful tools for the study of gene function in vivo. While several conditional systems were successful in invertebrates, in mice the Cre/loxP recombination system and the tet-controlled transcription activation system are predominant. Both expression systems allow for spatial and temporal control of gene activities, and, in the case of tet regulation, even for the reversible activation/inactivation of gene expression. Although the rat is the principal experimental model in biomedical research, in particular in studies of neuroscience, conditional rat transgenic systems are exceptionally rare in this species. Results We addressed this lack of technology, and established and thoroughly characterized CreERT2 and tTA transgenic rats with forebrain-specific transgene expression, controlled by the CaMKII alpha promoter. In addition, we developed new universal rat reporter lines for both transcription control systems and established inducible and efficient reporter gene expression in forebrain neurons. Conclusions We demonstrate that conditional genetic manipulations in the rat brain are both feasible and practicable and outline advantages and limitations of the Tet and Cre/loxP system in the rat brain.</p

Immune synapse formation determines interaction forces between T cells and antigen-presenting cells measured by atomic force microscopy

During adaptive immune responses, T lymphocytes recognize antigenic peptides presented by MHC molecules on antigen-presenting cells (APCs). This recognition results in the formation of a so-called immune synapse (IS) at the T-cell/APC interface, which is crucial for T-cell activation. The molecular composition of the IS has been extensively studied, but little is known about the biophysics and interaction forces between T cells and APCs. Here, we report the measurement of interaction forces between T cells and APCs employing atomic force microscopy (AFM). For these investigations, specific T cells were selected that recognize an antigenic peptide presented by MHC-class II molecules on APCs. Dynamic analysis of T-cell/APC interaction by AFM revealed that in the presence of antigen interaction forces increased from 1 to 2 nN at early time-points to a maximum of ≈14 nN after 30 min and decreased again after 60 min. These data correlate with the kinetics of synapse formation that also reached a maximum after 30 min, as determined by high-throughput multispectral imaging flow cytometry. Because the integrin lymphocyte function antigen-1 (LFA-1) and its counterpart intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) are prominent members of a mature IS, the effect of a small molecular inhibitor for LFA-1, BIRT377, was investigated. BIRT377 almost completely abolish the interaction forces, emphasizing the importance of LFA-1/ICAM-1-interactions for firm T-cell/APC adhesion. In conclusion, using biophysical measurements, this study provides precise values for the interaction forces between T cells and APCs and demonstrates that these forces develop over time and are highest when synapse formation is maximal