Identification of cytoplasm types in accessions of the family Brassicaceae (Brassicaceae Burnett) with DNA markers

Identification of cytoplasm types with the use of molecular markers enables to simplify the parent line pair selection for hybrid development based on CMS. Forty accessions of the family Brassicaceae (Brassicaceae Burnett) were analyzed with 22 pairs of PCR primers taken from previous research. Seven types of cytoplasm (Ogura, Ogu-NWSUAF, nap, pol, cam, rad, ole) were observed among breeding accessions using standard and multiplex PCR technique. The sequence of PCR products that differentiated different types of sterile cytoplasm confirmed the presence of three genes, orf138, orf222, and orf224, in mitochondrial DNA associated with exhibition of CMS. The accession of Nappa cabbage (Brassica rapa Pekinensis Group) had two genes, orf138 and orf222, which corresponded to cytoplasm Ogu-NWSUAF. All accessions carrying Ogura cytoplasm had the 417 bp fragment, which was 100 % identical to the mitochondrial orf138 gene sequence corres- pon­ding to Type А (formerly nine sequence Types, from A to I, had been identified). An exception was the accession of white head cabbage Tekila F1 with a new allelic variant of orf138 gene, which combined the 39-bp deletion typical of the Type F orf138 sequence and two nonsynonymous substitutions, A→T and G→A, at positions 95 and 99, respectively

Factors affecting DH plants <i>in vitro</i> production from microspores of European radish

Over the recent years the market demand for scaling up the production of European radish (Raphanus sativus L.) varieties and hybrids for open and protected production, varying in ripeness group, root shape and color, has drastically increased. Therefore, the expansion of genetic diversity and acceleration of the selection process are important. Doubled haploid technology considerably curtails the time required for creation of homozygous constant parental cell lines when in vitro microspore culture is used as the most promising method. For the first time, we were able to realize the full production cycle of DH plants of European radish by in vitro microspore culture up to inclusion of the produced material into the selection process. We have selected: preferable flower bud size, heat shock parameters, induction and regeneration media. It was revealed that linear length on the flower buds with the best possible stage of microspore development is genotype-specific: the flower bud length 2.8-3.3 mm is optimal for accessions of Rhodes and 3.7-4.2 mm is optimal for accessions of Teplichny Gribovsky. Heat shock at 32 °C for 48 hours is the most suitable for most genotypes. For the first time Murashige and Skoog based culture medium has been used for embryogenesis induction, and a major dependence of embryogenesis induction on the genotype x medium interaction was found. At regeneration and tiller stage it is advisable to add 1 mg/mL of benzylaminopurine and 0.1 mg/L of gibberellic acid to the medium, and rotting of micro-sprouts is performed with the use of hormone-free medium. Analysis of the produced regenerant plants by chromosome count and cell nucleus flow cytometry showed that 69 % of plants have a diploid chromosome set, 9 % have a haploid chromosome set, and 22 % have mixoploids and aneu-ploids chromosome sets. The seed progeny from doubled haploids and mixoploids were obtained by self-pollination, where all R1 plants had a doubled set of chromosomes. This study launches the development of an efficient method of radish doubled haploid production to be used in the selection process

Технология укоренения удвоенных гаплоидов редиса европейского, полученных в культуре микроспор in vitro

Relevance. Doubled haploids (DH-plants) are excellent material for genetic research and breeding due to their complete homozygosity. The genus Raphanus from the Brassicaceae family is the toughest to produce doubled haploid plants through isolated microspore culture in vitro (IMC). The study of the causes of disturbed root formation and the development of elements of this stage of technology will significantly increase the effectiveness of the IMC technology for European radish.Methods. The study included three varieties from the collection of the Federal State Budgetary Scientific Institution Federal Scientific Vegetable Center (FSBSI FSVC): Teplichny Gribovsky, Rozovo-krasniy s belim konchikom and Rhodes. The experiments used a standard protocol for obtaining DH plants using IMC technology in a standard form and with a modification of the rooting stage. The solid MS medium (with agar 7g/L): MS without hormones, MS medium supplemented with IAA at concentrations of 0.5; 1 and 2 mg / L and liquid MSm medium supplemented with 0.1 mg / L kinetin were used for rooting of regenerated plants. All media were supplemented with 20 g/L sucrose. We used three types of techniques for transplanting plant explants onto a solid hormonefree MS medium: planting micro-shoots with their basal part immersed by 2-3 mm into the medium; planting in a well made in a nutrient medium using tweezers under sterile conditions; and landing on the surface of the medium without embedment.Results. In this work, we studied the features of the stage of rooting of regenerated European radish plants in vitro conditions. The transplant technique has been proven to be important for the successful establishment of radish micro-shoots. Plant explants must be planted strictly on the surface of a solid hormone-free nutrient medium MS, without embedment. The use of tubes with bridges made of filter paper and MSm liquid medium with the addition of 0.1 mg/L kinetin for the induction of root formation also showed high efficiency. For plants prone to the formation of root-like structures (RLS) with secondary tumors (ST), multiple dissection of abnormal formations with successive transplants is necessary. Modification at the rooting stage of micro-shoots growing has increased the percentage of successfully adapted DH plants in vivo conditions from 0-14% to 95-98%.Актуальность. Удвоенные гаплоиды (DH-растения), являются превосходным материалом для генетических исследований и селекции за счет полной гомозиготности. Род Rathanus в семействе Brassicaceae является самым не отзывчивым к технологии получения удвоенных гаплоидов с помощью культуры изолированных микроспор in vitro (IMC). Изучение причин нарушения корнеобразования у растений-регенерантов и отработка элементов этого этапа технологии, позволит значительно повысить эффективность IMC технологии для редиса европейского.Методы. В исследование были включены три сортообразца из коллекции ФГБНУ «Федеральный научный центр овощеводства» (ФГБНУ ФНЦО): Тепличный Грибовский, Розово-красный с белым кончиком и Родос. В ходе экспериментов использовали стандартный протокол получения DH-растений с помощью IMC технологии в стандартном виде и с модификацией этапа укоренения. Для укоренения использовали твердую (агар 7 г/л) среду MS: безгормональная и MS с добавлением ИУК (в концентрациях 0,5; 1 и 2 мг/л) и жидкая питательная среда MSm с 0,1 мг/л кинетина. Концентрация сахарозы во всех средах составляла 20 г/л. Использовали три вида техники пересадки растительных эксплантов на агаризованную безгормональную среду MS: посадка микропобегов с погружением их базальной части на 2-3 мм в среду; посадка в лунку, сделанную в питательной среде с помощью пинцета в стерильных условиях; и посадка на поверхность среды без заглубления.Результаты. В настоящем исследовании изучены особенности этапа укоренения растенийрегенерантов редиса европейского в условиях in vitro. Показано, что для успешного укоренения микропобегов редиса важна техника пересадки. Растительные экспланты необходимо высаживать строго на поверхность твердой безгормональной питательной среды MS без заглубления. Использование для индукции корнеобразования жидкой среды MSm с добавлением 0,1 мг/л кинетина в пробирках с мостиками из фильтровальной бумаги также показала высокую эффективность. Для растений, склонных к образованию корнеплодоподобных структур (КС) с вторичными опухолями (ВО), необходима многократная диссекция аномальных образований с последовательными пересадками. Модификация этапа укоренения микропобегов повысила процент успешной адаптации DH-растений в условиях in vivo с 0-14% до 9598%

Оптимизация этапов технологии получения удвоенных гаплоидов кабачка (Cucurbita pepo L.) в культуре неопыленных семяпочек in vitro

Relevance. To create an effective technology for obtaining doubled haploids (DH-technology) of zucchini in unpollinatedseedpod culture in vitro it is necessary to select the optimal values of many factors, the degree of influence of each of which on gynogenesis can vary significantly. The aim of the study was to optimize the individual stages of the technology.Methods. Liquid and agarized (7 g/L) IMC medium with different sucrose concentrations (20 to 80 g/L) and different plant growth regulators (2 mg/L 2,4 D; 0.2 mg/L TDZ ; 0.8 mg/L 2,4 D and 1.2 mg/L NUC) were used for induction of embryogenesis.Results. Optimal for the studied zucchini genotypes was pre-isolated from the evening, plucked in the morning opened bud. Sterilization of zucchini ovaries by short-term burning after treatment with 96% alcohol, allows significant reduction of the time required for this step without loss of embryogenic potential. IMC nutrient medium with sucrose (20 to 40 g/l) can be used for induction of gynogenesis in the unpollinatedzucchini ovary culture. The use of nutrient media with 2 mg/l 2,4 D for most genotypes was more effective and resulted in higher number of embryoids compared to nutrient media containing 0.2 mg/l TDC and media with 0.8 mg/l 2,4 D and 1.2 mg/l NAA. Embryoid formation was observed after 5 weeks of cultivation.Conclusion. We were able to complete the full cycle of technology for obtaining doubled haploids in unpollinatedseedpod culture in vitro for 30 zucchini genotypes and obtain DHplants, which are valuable source material for both breeders and genetic research. Optimization of the individual steps of the technology made it possible to achieve the maximum result for individual genotypes – 55 embryoids per 100 cultivated ovules.Актуальность. Для создания эффективной технологии получения удвоенных гаплоидов (DH-технологии) кабачка в культуре неопыленных семяпочек in vitro необходимо подобрать оптимальные значений многих факторов, степень влияния каждого из которых на гиногенез может существенно отличаться. Целью исследования являлась оптимизация отдельных этапов технологии.Методы. Для индукции эмбриогенеза использовали жидкую и агаризованную (7 г/л) среду IMC с различной концентрацией сахарозы (от 20 до 80 г/л) и различными регуляторами роста растений (2 мг/л 2,4 D; 0,2 мг/л ТДЗ; 0,8 мг/л 2,4 D и 1,2 мг/л НУК).Результаты. Оптимальным для изученных генотипов кабачка оказался предварительно заизолированный с вечера, сорванный утром раскрывшийся бутон. Стерилизация завязей кабачка краткосрочным обжиганием после обработки 96% спиртом, позволяет существенно сократить временные затраты на этот этап без потери эмбриогенного потенциала. Для индукции гиногенеза в культуре неопыленных семяпочек кабачка возможно использовать жидкую питательную среду IMC c сахарозой от 20 до 40 г/л. Использование питательной среды с 2 мг/л 2,4 D для большинства генотипов оказалось более эффективным и позволяло получить большее количество эмбриоидов, по сравнению с питательной средой содержащей 0,2 мг/л ТДЗ и со средой с 0,8 мг/л 2,4 D и 1,2 мг/л НУК. Образование эмбриоидов наблюдалось уже через 5 недель культивирования.Заключение. Нам удалось завершить полный цикл технологии получения удвоенных гаплоидов в культуре неопыленных семяпочек in vitro для 30 генотипов кабачка и получить DH-растения, которые являются ценным исходным материалом как для селекционеров, так и для генетических исследований. Оптимизация этапов технологии позволила достичь максимального результата для отдельных генотипов – 55 эмбриоидов на 100 культивируемых семяпочек

КЛАССИФИКАЦИЯ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ СОРТОВ КАПУСТЫ BRASSICA OLERACEA L. C ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ SSR МАРКЕРОВ

It is important to reveal the genetic base of breeding genetic material used for development of new breeding accessions among diverse Brassica oleracea L. (CC, 2n = 18). Traditional varieties, hybrids and new ones recently developed are the main genetic resources.Classification of a collection with DNA markers enables to reveal valuable genotypes and establish the breeding accession pedigree that allows developing the new accessions with sustainable economically valuable traits. The use of microsatellite markers (SSR) in B.oleracea L. has shown high efficiency in discovering genetic polymorphism between varieties and within varieties as well. In this study, 16 primer pairs have been taken to amplify microsatellite loci of genomic DNA in national 24 breeding accessions of cabbage. On the basis of the data obtained the dendrogram has been constructed with use of Jaccard’s coefficient. All locistudied were high informative, where 14 out of 16 had a PIC &gt; 0.5. As a result, the level of genetic polymorphism has reached 85.7%. The large cluster of head cabbages consists of three subclusters: mid-maturing and early-maturing accessions of white head cabbage, red head and savoy cabbages, late-maturing and midmaturing accessions of white head cabbage, respectively. Maximum genetic distance in the cluster of head cabbages was obtained between head cabbage ‘Slava 231’ and ‘Vertu 1340’ with genetic similarity 44.7%. The two varieties of red head cabbage ‘Gako 741’ and ‘Kamennaya Golovka 447’ were genetically similar at 71.1%. The relatively low genetic similarity of these varieties can be explained by that they belong to different varietal groups. The most genetically closest varieties were ‘Zimovka 1474’ and ‘Podarok‘ with genetic similarity 86,5%. Information on topologic differentiation obtained from cluster analysis can be the basis for selection of genetically valuable breeding material with the use of DNA markers (Marker Assisted Selection).Для получения новых селекционных форм среди разнообразных представителей вида Brassica oleracea L. (CC, 2n = 18) необходимо знать генетическую основу используемого селекционного материала. Традиционные сорта и новые сорта, гибриды, появляющиеся в последнее время, составляют основные генетические ресурсы. Классификация коллекций с использованием ДНК маркеров позволяет выделить ценные генотипы и установить родословные селекционного материала, с тем, чтобы в дальнейшем получать новые формы с набором ценных признаков. Использование микросателлитных маркеров (SSR) в виде B. oleracea L. показало высокую эффективность по выявлению полиморфизма между разновидностями, между сортами и внутри сортов. В данной работе было взято 16 пар праймеров для амплификации микросателлитных локусов геномной ДНК 24 отечественных селекционных образцов капусты. Все оцененные локусы характеризовались высокой информативностью: 14 из 16 имели уровень PIC &gt; 0,5. На основе полученных данных была построена дендрограмма на основе коэффициента Джаккарда. В результате оценку генетического разнообразия проводили по 91 полученной микросателлитной аллели, где уровень наблюдаемого полиморфизма составил 85,7%. Большой кластер кочанных капуст состоял из трех подкластеров: в первом – среднеспелые и скороспелые образцы капусты белокочанной, во втором – краснокочанная и савойская капуста, в третьем – позднеспелые и среднеспелые образцы капусты белокочанной. Максимальное генетическое расстояние в кластере кочанных капуст с генетической схожестью всего 44,7% было обнаружено между капустой белокочанной Слава 231 и капустой савойской Вертю 1340. Два сорта капусты краснокочанной: Гако 741 и Каменная головка были генетически сходны между собой на 71,1%. Hевысокая степень генетической схожести этих образцов подтверждается тем, что эти сорта принадлежат к разным сортотипам. Наиболее генетически близкими оказались сорта капусты белокочанной Зимовка 1474 и Подарок с генетической схожестью 86,5%. Информация о топологической дифференциации коллекции капусты, полученная в результате кластерного анализа, является основой для селекционного отбора генетически ценного материала с использованием ДНК (т.е. маркер вспомогательной селекции)

ОБРАЗОВАНИЕ АНОМАЛЬНЫХ ЦВЕТКОВ В ПОТОМСТВЕ УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ КАБАЧКА (CUCURBITA PEPO L.)

The culture of unpollinated ovules in vitro in summer squash was used to develop fully homozygous breeding lines with the aim of the speeding-up breeding program. As a result of assessment for economically valuable traits, the seven promising DH-lines obtained from summer squash accessions differed by fruit shapes and colours were selected out. All breeding lines produced showed high homogeneity that retained in following generations and also have an appropriate set of economically valuable traits. DH-lines belonging to female type have up to 96% female flowers and only 4% male flowers. It is very important for breeding when the male flowers appeared in two weeks just after the female flower began blooming. The development of morphologically abnormal female and male flowers, along with gynandromorphy flowers was noted on selected DH-lines. During vegetation period from 26 to 36 flowers appeared on the plant, where out of them 19-21 ones were normally developed female flowers, 3-5 ones were normally developed male flowers, and up to 10-11 ones showed an abnormal way of development. The percentage of abnormal flowers stayed invariable when growing in greenhouse condition with high humidity and temperature as well as in open field condition. As it was shown the development of deformed abnormal flowers inherited and manifested in the following generation after self-pollination. As a result of the study, the occurred anomalies in course of male and female flower development in summer squash (C. pepo L.,) DH-lines produced through a cultivation of unpollinated ovules in vitro were described in details for the first time.Культуру неопыленных семяпочек кабачка in vitro использовали для создания полностью гомозиготных линий с целью ускорения селекционного процесса. В результате проведенной оценки по хозяйственно ценным признакам было выделено семь перспективных DH-линий, полученных из разных селекционных образцов кабачка, отличающихся по форме и окраске плода. Все полученные линии отличались высокой однородностью, сохраняющейся при последующем размножении, и были наделены комплексом хозяйственно ценных признаков. DH-линии относились к женскому типу и имели до 96% женских цветков и лишь 4% мужских, причем мужские цветки появлялись через две недели после начала цветения женскими цветками, что представляет большую селекционную ценность. На отобранных DH-линиях было отмечено формирование морфологически аномальных женских и мужских цветков, а также гинандроморфных цветков. За период вегетации на одном растении образовывалось от 26 до 36 цветков, при этом 19-21 штук из них были нормально развитыми женскими цветками, 3-5 штук – нормальными мужскими цветками и до 10-11штук цветков развивались с той или иной аномалией. Процент уродливых цветков на этих линиях оставался неизменным, как при выращивании этих линий в пленочной теплице, где температура воздуха и влажность была достаточно высокой, так и в условиях открытого грунта. При самоопылении этих линий образование уродливых аномальных цветков наследовалось и проявлялось у потомства. В результате проведенной работы были описаны встречающиеся аномалии в развитии мужских и женских цветков кабачка C. pepoL., обнаруженные в DH-линиях, полученных через культуру неопыленных семяпочек in vitro, часть из которых была обнаружена впервые

ЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА УДВОЕННЫХ ГАПЛОИДОВ КАБАЧКА (CUCURBITA PEPO L.)

147 new forms were obtained only from nine responsive unpollinated ovules of summer squash in 2015-2017. The cytological analysis is used to estimate the level of ploidy in regenerated plants R0. The small size of mitotic chromosomes and large number in Cucurbita genus make it difficult to count them even though they are well separated. As a result of analysis the optimal method of chromosome staining has been chosen with the use of modified propiono- lacmoid cytological technique. The rootlet tips and apical meristems were used to make smear preparations. As it was shown the summer squash was a difficult species as a cytological object because of low mitosis frequency and low number of metaphase plates with well scattered chromosomes. The photos of chromosomes in squash C. pepo subsp. brevicaulis var. giraumons Duch; distant hybrid (breeding accession N37) between variety ‘Cornishon’ and winter squash C. pepo subsp. longicaulis Greb. var. pepo and doubled haploid plants produced from them were made. In spite of the small size 2 μm the chromosomes observed were clearly seen. Nearly all regenerated plants that had been analyzed passed well the adaptation in vivo and occurred to be a doubled haploids (2n = 2x=40). The seed progeny was then obtained through self-pollination. About 20% of plants R0 analyzed were mixploids and supposedly only 7% were haploids.Из девяти отозвавшихся в культуре неопыленных семяпочек образцов кабачка в 2015-2017 годах было получено 147 новых генотипов. Для оценки уровня плоидности полученных растенийрегенерантов R0 кабачка необходимо проводить цитолог ический анализ. Малый размер митотических хромосом и их относительно большое количество в роде Cucurbita делает их трудными для точного подсчета, даже несмотря на то, что они, как правило, хорошо разделены. В результате проведенной работы была подобрана оптимальная методика окрашивания хромосом кабачка с использованием модернизированного нами пропионно-лакмоидного метода. При приготовлении давленных препаратов использовали меристемы стебля и кончиков корней. Кабачок оказался трудным в цитологическом плане объектом ввиду малой частоты митозов и небольшого числа метафаз с хорошим разбросом хромосом. В результате удалось получить микрофотографии хромосом кабачка C. pepo subsp. brevicaulis var. giraumons Duch и отдаленного гибрида (селекционный образец №37) между кабачком сорта Корнишонный и твердокорой тыквой C. pepo subsp. longicaulis Greb. var. pepo, а также полученных из них удвоенных гаплоидов. Несмотря на достаточно мелкие размеры (около 2 мкм), хромосомы на полученных микрофотографиях достаточно четко видны. Практически все проанализированные растения-регенеранты, успешно прошедшие этап адаптации к условиям in vivo, оказались удвоенными гаплоидами 2n = 2х = 40 и в последующем успешно завязали семена при самоопылении. Около 20% из проанализированных растений R0 были миксоплоидами, предположительно гаплоидных растений было 7%

ПОЛУЧЕНИЕ DH-РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР МОРКОВИ

The main goals of the research were to study the factors affecting on the process of embryogenesis in culture of isolated microspores, optimize the existing protocols, and finally produce the doubled haploid plants in carrot (DH-plants). Out of 10 carrot accessions tested in 2017 the embyoids were obtained in 8 carrot accessions with the use of 5 different media. The highest yield of embyoids was obtained in accessions 7kt (84 embryoids per Petri dish). It was shown that       optimal                explants              were     buds      containing microspores at late vacuolated uninucleate stage. The first divisions in microspores were seen in 3 days of cultivation. After 40 days, the welldeveloped embryoids can be observed by naked eye. It was also shown that further cultivation of these embryoids on medium with 13% agarose over 60 days provoked the active secondary embryoid formation. Owing to this, it is recommended to place the embryoids at heart-shaped stages on another regeneration medium supplied with 2 % of agarose, enabling to register correctly the number of well-formed embryoids. We carried out the study on influence of such factors as genotype and composition of medium, and their combination on embryoid formation in 8 genotypes on 5 various media. ANOVA analysis showed that the plant genotype was the main factor causing the embryoid formation, whereas the effect of both factors had an impact on the number of embryoids developed. The counting the chromosome number in meristem cells and also observation of chloroplast number in stoma guard cells enabled to reveal that most of the plants produced were the doubled haploidsЦелью данного исследования было изучить факторы, влияющие на процесс эмбриогенеза в культуре изолированных микроспор in vitro, оптимизировать существующие протоколы и получить удвоенные гаплоиды моркови (DH-растения). Из 10 изученных в 2017 году сортообразцов нам удалось получить эмбриоиды у 8 сортообразцов с использованием 5 различных вариантов питательных сред. Наибольший выход эмбриоидов наблюдался у селекционного образца 7кт (84 эмбриоида на чашку Петри). Было отмечено, что оптимальными для введения в культуру являются бутоны, содержащие преимущественно микроспоры на поздней вакуолизированной стадии развития. Первые деления в культуре микроспор моркови под микроскопом были обнаружены уже через 3 дня после начала культивирования. На 40 сутки эмбриоиды были хорошо сформированы и видны невооруженным глазом. Было отмечено, что если продолжать культивировать эмбриоиды на питательной среде с 13% сахарозой более 60 суток, то активно начинается процесс образования вторичных эмбриоидов. В связи с этим мы рекомендуем эмбриоиды на сердцевидной стадии развития сразу же переносить в отдельные пробирки на регенерационную среду с 2% сахарозой, чтобы вести правильный учет образовавшихся эмбриоидов. Мы провели изучение влияния факторов генотипа и питательной среды, а также их совместного действия на образование эмбриоидов у 8 генотипов моркови на 5 различных питательных средах. Проведенный двухфакторный дисперсионный анализ показал, что генотип является главным фактором определяющим образование эмбриоидов из микроспор, а совместное действие обоих факторов также определяет количество образовавшихся эмбриоидов. Прямым подсчетом числа хромосом в меристематических клетках и с использованием метода подсчета хлоропластов в замыкающих устьичных клетках было установлено, что почти все полученые растения были удвоенными гаплоидами

Получение удвоенных гаплоидов Cucurbita pepo L.

Doubled haploids have been widely used worldwide in breeding programs and fundamental research as valuable homozygous material for about 100 years. The species Cucurbita pepo L. are represented by a huge variety of forms, include highly productive vegetable crops and have a wide distribution in the world. Despite the great economic importance, the creation of effective protocols to ensure stable production of doubled haploids in this species remains an urgent task. DH plants are of interest not only because of the acceleration of the breeding process, but also because of the realization of the huge potential of gametoclonal variability inherent in this highly polymorphic species. In this review, we analyzed the main technologies used for obtaining doubled haploids in vegetable crops of C. pepo: parthenogenesis in situ stimulated by treated/irradiated pollen, gynogenesis in vitro (unpollinated ovule culture in vitro) and androgenesis in vitro (anther/microspore culture in vitro). An analysis is presented of the research carried out from the beginning of the discovery of haploid plants to the current advances and evaluation of the prospects in the field of DH plant production. The main critical factors influencing the efficiency of each technology and its individual steps are considered. The developed technology of doubled haploids obtaining using non-pollinated ovary culture in vitro is presented. This technology allows to obtain up to 55 embryoids per one cultivated ovary (28 embryoids/ 100 cultivated ovules) To introduce haploid technologies into the breeding process it is necessary to evaluate the obtained plants for ploidy level. The use of direct counting of chromosomes in apical cells may present a certain difficulty in this species due to their large number (2n=40) and their small size. Depending on the level of laboratory equipment, ploidy determination using flow cytometry of cell nuclei and counting the number of chloroplasts in stomatal guard cells in the epidermis of the abaxial side of the leaf may be more convenient methods. The prospects for the use of molecular markers for assessment for homozygosity in DH technologies used, including C. pepo, are discussed in the review.Удвоенные гаплоиды уже около 100 лет используются во всем мире в селекционных программах и фундаментальных исследованиях как ценный гомозиготный материал. Вид Cucurbita pepo L. представлен огромным многообразием форм, включает высокопродуктивные овощные культуры и имеет широкое распространение в мире. Несмотря на большую экономическую значимость, создание эффективных протоколов, обеспечивающих стабильное получение удвоенных гаплоидов у этого вида остается актуальной задачей. Получение DH-растений представляет интерес не только по причине ускорения селекционного процесса, но и за счет реализации огромного потенциала гаметоклональной изменчивости, заложенной у этого высоко полиморфного вида. В обзоре рассмотрены основные использующиеся технологии получения удвоенных гаплоидов у овощных культур C. pepo: партеногенез in situ стимулированный обработанной/облученной пыльцой, гиногенез in vitro (культура неопыленных семяпочек in vitro) и андрогенез in vitro (культура пыльников/микроспор in vitro). Представлен анализ исследований, проведенных с начала открытия гаплоидных растений до современных достижений и оценки перспектив в области получения DH растений. Рассмотрены основные критические факторы, влияющие на эффективность каждой из технологий и ее отдельных этапов. Представлена разработанная технология получения удвоенных гаплоидов кабачка с использованием культуры неопыленных семяпочек in vitro, позволяющая получать до 55 эмбриоидов на 1 культивируемую завязь (28 эмбриоидов/100 культивируемых семяпочек). Для внедрения гаплоидных технологий в селекционный процесс необходимо полученные растения-регенеранты оценивать на уровень плоидности. Использование прямого подсчета хромосом в апикальных клетках может представлять определенную сложность у этого вида ввиду большого их количества (2n=40) и их малого размера. В зависимости от уровня оснащения лаборатории определение плоидности с использованием проточной цитометрии клеточных ядер и подсчета количества хлоропластов в замыкающих клетках устьиц в эпителии абаксиальной стороны листа, может быть более удобными методами. В обзоре рассмотрены перспективы использования молекулярных маркеров для оценки на гомозиготность при DH-технологиях, в том числе и у C. pepo

Fungal colonization in Cystic Fibrosis (CF): Epidemiology and antifungal resistance in a French cohort of CF patients – Focused on Aspergillus fumigatus colonization

Introduction: Cystic fibrosis (CF) is the major genetic inherited disease in the European Caucasian population, with an average of 1 in 3000 living births in France. Prognostic depend essentially on the lung impairments. While considerable attention therefore has been paid over recent decades to prevent and treat bacterial respiratory infections, we observed emergence of fungi colonization in CF respiratory tract. In particular, Aspergillus fumigatus represents the most common causative agent colonizing the airways of CF patients; it can be responsible for Allergic Bronchopulmonary Aspergillosis (ABPA). Since oral corticosteroids and itraconazole represent the mainstay of ABPA treatment, long-term therapy may increase the risk of acquired resistance to azoles that is mainly associated with amino acid substitutions in the CYP51A gene of A. fumigatus. Objective: First, we managed to have exhaustive epidemiological data on species of filamentous fungi able to colonize the airway tract of 300 CF patients followed-up in our national prospective study ("MucoFong" study – PHRC1902). Second, CF patients being chronically exposed to azole (especially to itraconazole), our study aimed to evaluate the prevalence of azole resistance in isolates prospectively collected from CF patients followed-up in seven French hospitals involved in our national prospective study. Third, we focused on the most prevalent species: Aspergillus fumigatus, studying the azole resistance at molecular level. To our knowledge, it is the first multicenter study focused on azole resistance of A. fumigatus in CF. Methods: A total of 243 sputa were analyzed using the same protocol in each centre. The MICs of antifungal drugs were evaluated for each isolate using the E-test ® strips. Focusing on A. fumigatus, a total of 87 isolates was collected in 85 patients. These isolates were characterized at the molecular level by targeting ITS, ß-tubulin and MAT-A/α genes. The CYP51A gene as well as its promoter was sequenced; a 3D Cyp51A protein homology model was built. Results and discussion: 300 patients were enrolled in this study. At inclusion time, most of them were adults colonized with A. fumigatus (about 35% of the patients). Scedosporium was isolated in 5%, and Exophiala in about 2%. Regarding antifungal susceptibility, isolates of Scedosporium and Exophiala exhibited antifungal resistance comparable with published data. Regarding A. fumigatus, a majority of isolates (88.1%) were found sensitive to itraconazole (MIC≤ 2μg/ml), and 2 new mutations were identified and localized within 3-dimensional Cyp51A protein model. To obtain insight into azole resistance of A. fumigatus, the results are analyzed taking into account clinical data, itraconazole exposition, and the potential correlation between the identified CYP5IA mutations and azole resistance is discussed based on the Cyp51A protein homology model