NOTCH3 inactivation increases triple negative breast cancer sensitivity to gefitinib by promoting EGFR tyrosine dephosphorylation and its intracellular arrest.

Notch dysregulation has been implicated in numerous tumors, including triple-negative breast cancer (TNBC), which is the breast cancer subtype with the worst clinical outcome. However, the importance of individual receptors in TNBC and their specific mechanism of action remain to be elucidated, even if recent findings suggested a specific role of activated-Notch3 in a subset of TNBCs. Epidermal growth factor receptor (EGFR) is overexpressed in TNBCs but the use of anti-EGFR agents (including tyrosine kinase inhibitors, TKIs) has not been approved for the treatment of these patients, as clinical trials have shown disappointing results. Resistance to EGFR blockers is commonly reported. Here we show that Notch3-specific inhibition increases TNBC sensitivity to the TKI-gefitinib in TNBC-resistant cells. Mechanistically, we demonstrate that Notch3 is able to regulate the activated EGFR membrane localization into lipid rafts microdomains, as Notch3 inhibition, such as rafts depletion, induces the EGFR internalization and its intracellular arrest, without involving receptor degradation. Interestingly, these events are associated with the EGFR tyrosine dephosphorylation at Y1173 residue (but not at Y1068) by the protein tyrosine phosphatase H1 (PTPH1), thus suggesting its possible involvement in the observed Notch3-dependent TNBC sensitivity response to gefitinib. Consistent with this notion, a nuclear localization defect of phospho-EGFR is observed after combined blockade of EGFR and Notch3, which results in a decreased TNBC cell survival. Notably, we observed a significant correlation between EGFR and NOTCH3 expression levels by in silico gene expression and immunohistochemical analysis of human TNBC primary samples. Our findings strongly suggest that combined therapies of TKI-gefitinib with Notch3-specific suppression may be exploited as a drug combination advantage in TNBC treatment

Notch3 contributes to T-cell leukemia growth via regulation of the unfolded protein response

Unfolded protein response (UPR) is a conserved adaptive response that tries to restore protein homeostasis after endoplasmic reticulum (ER) stress. Recent studies highlighted the role of UPR in acute leukemias and UPR targeting has been suggested as a therapeutic approach. Aberrant Notch signaling is a common feature of T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL), as downregulation of Notch activity negatively affects T-ALL cell survival, leading to the employment of Notch inhibitors in T-ALL therapy. Here we demonstrate that Notch3 is able to sustain UPR in T-ALL cells, as Notch3 silencing favored a Bip-dependent IRE1α inactivation under ER stress conditions, leading to increased apoptosis via upregulation of the ER stress cell death mediator CHOP. By using Juglone, a naturally occurring naphthoquinone acting as an anticancer agent, to decrease Notch3 expression and induce ER stress, we observed an increased ER stress-associated apoptosis. Altogether our results suggest that Notch3 inhibition may prevent leukemia cells from engaging a functional UPR needed to compensate the Juglone-mediated ER proteotoxic stress. Notably, in vivo administration of Juglone to human T-ALL xenotransplant models significantly reduced tumor growth, finally fostering the exploitation of Juglone-dependent Notch3 inhibition to perturb the ER stress/UPR signaling in Notch3-dependent T-ALL subsets

Analisi del crosstalk tra i recettori Notch3 ed EGFR nei tumori Triplo Negativi: nuovi possibili approcci terapeutici

BACKGROUND E SCOPO DELLA TESI. Il cancro della mammella rappresenta la forma tumorale più comune nelle donne. Sulla base dell’espressione di specifici geni, che codificano per il recettore degli estrogeni, del progesterone e del recettore tirosin-chinasico ErbB2, si classificano in almeno 5 gruppi distinti. Tra questi, i cosiddetti tumori “Triplo-Negativi” (TN), mancanti dell’espressione di tutti i recettori precedentemente menzionati rappresentano la categoria più aggressiva. Data l’elevata eterogeneità di questo sottotipo tumorale risulta difficile individuare dei validi bersagli terapeutici. Pertanto, i TN sono associati ad una prognosi piuttosto infausta. Circa il 60% dei tumori Triplo-Negativi mostra un’aumentata espressione del recettore tirosin- chinasico EGFR, coinvolto sia nella sopravvivenza e progressione del tumore, sia nella risposta terapeutica. Un tumore che sovraesprime l’EGFR può prevedere in linea teorica un trattamento farmacologico combinato che includa anche l’uso di bloccanti dello stesso recettore (inibitori dell’attività tirosin-chinasica, TKIs, o anticorpi bloccanti la dimerizzazione recettoriale). Seppur utilizzati con maggiore successo soprattutto nel trattamento dei tumori del polmone, ad oggi questi inibitori hanno mostrato un’attività clinica limitata nei tumori della mammella, soprattutto nei TN. Si può supporre che la ragione principale di questo fallimento risieda nel fatto che molti tumori TN non sono esclusivamente dipendenti dall’EGFR per la loro sopravvivenza, bensì presentino un’attivazione persistente di meccanismi di segnalazione alternativi, spesso a valle della via di segnalazione dell’EGFR stesso, in ultimo responsabili dell’insorgenza di resistenza agli stessi anti-EGFR. In questo contesto si inserisce la via di segnalazione dei recettori Notch, notoriamente coinvolta in una serie di eventi che consentono alle cellule tumorali di: diventare resistenti ai trattamenti mirati, promuovere la transizione epitelio-mesenchima (EMT), metastatizzare, promuovere la sopravvivenza e l’autorinnovamento delle cellule staminali cancerose. Ad oggi numerosi studi hanno suggerito una relazione importante tra i recettori EGFR e Notch, con effetto agonista o meno a seconda dei diversi contesti cellulari, compreso quello dei tumori mammari. In particolare, nei tumori TN è stato dimostrato che l’inibizione combinata di entrambe i recettori EGFR e Notch, rispetto all’inibizione singola, risulta essere molto più efficace nel sopprimere la progressione tumorale sia in vitro che in vivo. Ad oggi, l’unica forma d’inibizione della via di segnalazione di Notch in fase di sperimentazione clinica è rappresentata dagli inibitori delle gamma-secretasi (GSIs), ovvero del complesso di proteine deputate al taglio proteolitico responsabile del rilascio del dominio intracellulare dei recettori, così libero di traslocare nel nucleo ed attivare la trascrizione di geni specifici. In tal modo questi inibitori agiscono ad ampio spettro. Tuttavia, uno dei maggiori problemi legati all’utilizzo dei GSIs risiede nei molteplici effetti collaterali ad essi associati, principalmente rappresentati dall’elevata citotossicità riscontrata nel tratto gastrointestinale. L’inibizione selettiva di un singolo recettore Notch (o di un suo ligando) potrebbe quindi ridurre la tossicità del trattamento ed aumentarne l’efficacia. Questo presuppone la conoscenza approfondita del ruolo dei diversi recettori Notch nello specifico contesto tumorale considerato. E’ stato infatti dimostrato che la funzionalità dei diversi recettori Notch può non seguire necessariamente una regola arbitraria: sembra piuttosto che possano comportarsi in modo diverso tra loro, nei differenti contesti tumorali o anche all’interno dello stesso tipo di tumore. Sulla base di queste considerazioni la linea di ricerca seguita per questo lavoro di Tesi si è proposta di indagare l’asse EGFR-Notch nei tumori mammari TN, con particolare riferimento ai recettori Notch3 e Notch1, nell’ambito della risposta cellulare al trattamento con l’anti-TKI gefitinib. RISULTATI. Abbiamo condotto i nostri studi utilizzando come modello sperimentale cellule di carcinoma mammario TN EGFR+ MDA-MB-468, sovra-esprimenti entrambe i recettori Notch3 e Notch1, e notoriamente resistenti agli anti-EGFR. Abbiamo dimostrato che: 1. la sopravvivenza delle cellule TN è Notch3-dipendente piuttosto che Notch1-dipendente. 2. l’assenza di Notch3 (e non di Notch1) correla con un’evidente diminuzione della percentuale di cellule ciclanti e con una corrispondente modulazione di proteine coinvolte nella progressione nel ciclo cellulare (ciclina D1 e D3, p27). 3. l’assenza di Notch3 (e non di Notch1) correla con un’importante risensibilizzazione al gefitinib. Questi dati dimostrano che i due recettori Notch possono svolgere funzioni diverse all’interno dello stesso contesto tumorale TN e suggeriscono la possibilità di un “crosstalk” differenziato con l’EGFR, con il quale abbiamo dimostrato che entrambe sono in grado di interagire direttamente. Passo successivo è stato quindi quello di focalizzare la nostra attenzione sullo studio dell’asse Notch3-EGFR, al fine di identificare il meccanismo molecolare che sottointende la risensibilizzazione al farmaco osservata. Abbiamo quindi analizzato il possibile ruolo di Notch3 su meccanismi noti per favorire lo spegnimento del segnale del recettore EGFR. In particolare, in seguito al silenziamento di Notch3, da solo o in combinazione con il gefitinib, abbiamo osservato: 4. un’importante riduzione dei livelli di fosforilazione dell’EGFR nel sito di auto-fosforilazione Y1173, notoriamente implicato nell’attivazione del signaling del recettore. In aggiunta, questo dato correla con una diminuita traslocazione nucleare dell’EGFR stesso, localizzazione generalmente associata ad un fenotipo tumorale più aggressivo. 5. una significativa internalizzazione dell’EGFR, di solito molto difficile da osservare nelle cellule MDA-MB-468 a causa degli elevati livelli d’espressione dello stesso recettore. Questi dati suggeriscono un ruolo importante di Notch3, nel mantenimento persistente dell’EGFR a livello di membrana, in uno stato costitutivamente attivo, e quindi presumibilmente “pronto” per divenire rapidamente “targettabile” da agenti anti-EGFR nel momento in cui viene bloccato l’elemento fondamentale per la sopravvivenza di queste cellule, Notch3 appunto. Al contrario, risultati preliminari ci suggeriscono che l’assenza di Notch1 non comporta le stesse modificazioni funzionali dell’EGFR descritte nei punti 4 e 5, possibile ragione della mancanza di ri-sensibilizzazione al gefitinib osservata dopo silenziamento di Notch1 (punto 3). Pertanto, sulla base dei dati finora ottenuti possiamo affermare che il recettore Notch3 (e non Notch1) è in grado di influenzare il “turnover” del recettore EGFR in cellule di tumori TN. Dal punto di vista strettamente meccanicistico, il nostro punto di partenza è stato uno studio recente nel quale si dimostra che il recettore EGFR è preferenzialmente localizzato al livello dei rafts lipidici della membrana plasmatica di cellule di carcinoma mammario TN resistenti ai TKIs rispetto a quelle sensibili. Abbiamo condotto studi iniziali a livello di questo particolare compartimento cellulare tramite esperimenti di isolamento biochimico e di immunofluorescenza. Abbiamo osservato una diversa localizzazione dei recettori Notch: se Notch3 è presente uniformemente nella membrana plasmatica, quindi sia a livello del compartimento rafts ma soprattutto in quello non-rafts, l’espressione di Notch1 in membrana sembra più esclusiva dei rafts, sovrapponendosi preferenzialmente con quella dell’EGFR stesso. Questi risultati preliminari ottenuti ci suggeriscono che la diversa localizzazione dei recettori Notch, condivisa o meno con l’EGFR, possa rappresentare il presupposto per spiegare il diverso meccanismo molecolare che sottintende la comunicazione Notch3-EGFR (e Notch1-EGFR) nel contesto della sensibilità/resistenza al gefitinib, Ulteriori indagini saranno necessarie per validare questi risultati. Seppur in corso di approfondimenti e di futura validazione in vivo, l’insieme dei risultati finora ottenuti e riportati nella presente tesi di Dottorato fornisce un valido supporto per l’identificazione di un nuovo marcatore molecolare, Notch3, associato con i meccanismi di resistenza agli inibitori anti-EGFR nei tumori mammari TN, che ad oggi trovano nell'insorgenza di resistenza al farmaco il principale ostacolo terapeutico. Lo scopo ultimo è quindi rappresentato dal potenziale sviluppo di nuove strategie di trattamento di tumori TN EGFR+Notch3+ che prevedano l’uso combinato di inibitori selettivi di Notch3 e farmaci anti-EGFR, ad oggi esclusi dalla pratica clinica dei tumori mammari (inclusi i TN) proprio per la scarsa risposta osservata nei “trials clinici”

NOTCH3 inactivation increases Triple Negative Breast Cancer sensitivity to gefitinib by promoting EGFR tyrosine dephosphorylation and its intracellular arrest.

Triple-negative breast cancer (TNBC) accounts for about 15-20% of breast cancers and represents the most aggressive subtype (1). To date, no molecularly targeted agents are approved for TNBC, leading to the conventional chemotherapy the role of primary option for systemic treatment. Therefore, effective therapeutic strategies for TNBC are urgently needed. The tyrosine kinase receptor EGFR overexpression is a hallmark of TNBC. Anti-EGFR therapies, including EGFR inhibitors, are not currently approved for breast cancer treatment, since the results from clinical trials are disappointing (2) due to the existence of compensatory pathways that confer resistance to EGFR inhibition. Notch signaling dysregulation is often associated with the pathogenesis and progression of TNBC (3). In addition, Notch-EGFR interplay occurs in breast cancer (4), raising the possibility that Notch signalling could be involved in the resistance to EGFR inhibition. Consequently, the combined Notch-EGFR pathway inhibition, in this context, is a potential therapeutic approach for overcoming resistance to drugs (5). Pan-Notch inhibition using gamma-secretase-inhibitors (GSIs) treatment supports this conclusion but it fails to distinguish the particular Notch receptor which drives growth. Therefore, it is relevant to investigate which is the main Notch receptor involved in the resistance to EGFR inhibition in order to understand the main strategy for TNBC cancer therapy. It has been demonstrated that constitutive Notch3 signalling can drive an oncogenic program in a subset of TNBCs, thus suggesting that Notch3 activity, and not others Notch paralogues, may be relevant in this breast cancer subtype (6)

NACK and INTEGRATOR act coordinately to activate Notch-mediated transcription in tumorigenesis

Abstract Background Notch signaling drives many aspects of neoplastic phenotype. Here, we report that the Integrator complex (INT) is a new component of the Notch transcriptional supercomplex. Together with Notch Activation Complex Kinase (NACK), INT activates Notch1 target genes by driving RNA polymerase II (RNAPII)-dependent transcription, leading to tumorigenesis. Methods Size exclusion chromatography and CBF-1/RBPJ/Suppressor of Hairless/Lag-1 (CSL)-DNA affinity fast protein liquid chromatography (FPLC) was used to purify Notch/CSL-dependent complexes for liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) were performed to investigate transcriptional regulation of Notch target genes. Transfection of Notch Ternary Complex components into HEK293T cells was used as a recapitulation assay to study Notch-mediated transcriptional mechanisms. Gene knockdown was achieved via RNA interference and the effects of protein depletion on esophageal adenocarcinoma (EAC) proliferation were determined via a colony formation assay and murine xenografts. Western blotting was used to examine expression of INT subunits in EAC cells and evaluate apoptotic proteins upon INT subunit 11 knockdown (INTS11 KD). Gene KD effects were further explored via flow cytometry. Results We identified the INT complex as part of the Notch transcriptional supercomplex. INT, together with NACK, activates Notch-mediated transcription. While NACK is required for the recruitment of RNAPII to a Notch-dependent promoter, the INT complex is essential for RNAPII phosphorylated at serine 5 (RNAPII-S5P), leading to transcriptional activation. Furthermore, INT subunits are overexpressed in EAC cells and INTS11 KD results in G2/M cell cycle arrest, apoptosis, and cell growth arrest in EAC. Conclusions This study identifies the INT complex as a novel co-factor in Notch-mediated transcription that together with NACK activates Notch target genes and leads to cancer cell proliferation

Pharmacological disruption of the Notch1 transcriptional complex inhibits tumor growth by selectively targeting cancer stem cells

In many human cancers, deregulation of the Notch pathway has been shown to play a role in the initiation and maintenance of the neoplastic phenotype. Aberrant Notch activity also plays a central role in the maintenance and survival of cancer stem cells, which underlie metastasis and resistance to therapy. For these reasons, inhibition of Notch signaling has become an exceedingly attractive target for cancer therapeutic development. However, attempts to develop Notch pathway specific drugs have largely failed in the clinic, in part due to intestinal toxicity. Here we report the discovery of NADI-351, the first specific small molecule inhibitor of Notch1 transcriptional complexes. NADI-351 selectively disrupted Notch1 transcription complexes and reduced Notch1 recruitment to target genes. NADI-351 demonstrated robust anti-tumor activity without inducing intestinal toxicity in mouse models, and cancer stem cells were ablated by NADI-351 treatment. Our study demonstrates that NADI-351 is an orally available and potent inhibitor of Notch1-mediated transcription that inhibits tumor growth with low toxicity, providing a potential therapeutic approach for improved cancer treatment

A novel chemical attack on Notch-mediated transcription by targeting the NACK ATPase

Notch activation complex kinase (NACK) is a component of the Notch transcriptional machinery critical for the Notch-mediated tumorigenesis. However, the mechanism through which NACK regulates Notch-mediated transcription is not well understood. Here, we demonstrate that NACK binds and hydrolyzes ATP and that only ATP-bound NACK can bind to the Notch ternary complex (NTC). Considering this, we sought to identify inhibitors of this ATP-dependent function and, using computational pipelines, discovered the first small-molecule inhibitor of NACK, Z271-0326, that directly blocks the activity of Notch-mediated transcription and shows potent antineoplastic activity in PDX mouse models. In conclusion, we have discovered the first inhibitor that holds promise for the efficacious treatment of Notch-driven cancers by blocking the Notch activity downstream of the NTC. [Display omitted] Identification of the first-in-class NACK inhibitor that blocks the Notch-mediated transcription and shows antineoplastic activity in PDX mouse models