BACKGROUND E SCOPO DELLA TESI. Il cancro della mammella rappresenta la forma tumorale più comune nelle donne. Sulla base dell’espressione di specifici geni, che codificano per il recettore degli estrogeni, del progesterone e del recettore tirosin-chinasico ErbB2, si classificano in almeno 5 gruppi distinti. Tra questi, i cosiddetti tumori “Triplo-Negativi” (TN), mancanti dell’espressione di tutti i recettori precedentemente menzionati rappresentano la categoria più aggressiva. Data l’elevata eterogeneità di questo sottotipo tumorale risulta difficile individuare dei validi bersagli terapeutici. Pertanto, i TN sono associati ad una prognosi piuttosto infausta.
Circa il 60% dei tumori Triplo-Negativi mostra un’aumentata espressione del recettore tirosin- chinasico EGFR, coinvolto sia nella sopravvivenza e progressione del tumore, sia nella risposta terapeutica. Un tumore che sovraesprime l’EGFR può prevedere in linea teorica un trattamento farmacologico combinato che includa anche l’uso di bloccanti dello stesso recettore (inibitori dell’attività tirosin-chinasica, TKIs, o anticorpi bloccanti la dimerizzazione recettoriale). Seppur utilizzati con maggiore successo soprattutto nel trattamento dei tumori del polmone, ad oggi questi inibitori hanno mostrato un’attività clinica limitata nei tumori della mammella, soprattutto nei TN. Si può supporre che la ragione principale di questo fallimento risieda nel fatto che molti tumori TN non sono esclusivamente dipendenti dall’EGFR per la loro sopravvivenza, bensì presentino un’attivazione persistente di meccanismi di segnalazione alternativi, spesso a valle della via di segnalazione dell’EGFR stesso, in ultimo responsabili dell’insorgenza di resistenza agli stessi anti-EGFR.
In questo contesto si inserisce la via di segnalazione dei recettori Notch, notoriamente coinvolta in una serie di eventi che consentono alle cellule tumorali di: diventare resistenti ai trattamenti mirati, promuovere la transizione epitelio-mesenchima (EMT), metastatizzare, promuovere la sopravvivenza e l’autorinnovamento delle cellule staminali cancerose.
Ad oggi numerosi studi hanno suggerito una relazione importante tra i recettori EGFR e Notch, con effetto agonista o meno a seconda dei diversi contesti cellulari, compreso quello dei tumori mammari. In particolare, nei tumori TN è stato dimostrato che l’inibizione combinata di entrambe i recettori EGFR e Notch, rispetto all’inibizione singola, risulta essere molto più efficace nel sopprimere la progressione tumorale sia in vitro che in vivo.
Ad oggi, l’unica forma d’inibizione della via di segnalazione di Notch in fase di sperimentazione clinica è rappresentata dagli inibitori delle gamma-secretasi (GSIs), ovvero del complesso di proteine deputate al taglio proteolitico responsabile del rilascio del dominio intracellulare dei recettori, così libero di traslocare nel nucleo ed attivare la trascrizione di geni specifici. In tal modo questi inibitori agiscono ad ampio spettro. Tuttavia, uno dei maggiori problemi legati all’utilizzo dei GSIs risiede nei molteplici effetti collaterali ad essi associati, principalmente rappresentati dall’elevata citotossicità riscontrata nel tratto gastrointestinale. L’inibizione selettiva di un singolo recettore Notch (o di un suo ligando) potrebbe quindi ridurre la tossicità del trattamento ed aumentarne l’efficacia. Questo presuppone la conoscenza approfondita del ruolo dei diversi recettori Notch nello specifico contesto tumorale considerato. E’ stato infatti dimostrato che la funzionalità dei diversi recettori Notch può non seguire necessariamente una regola arbitraria: sembra piuttosto che possano comportarsi in modo diverso tra loro, nei differenti contesti tumorali o anche all’interno dello stesso tipo di tumore.
Sulla base di queste considerazioni la linea di ricerca seguita per questo lavoro di Tesi si è proposta di indagare l’asse EGFR-Notch nei tumori mammari TN, con particolare riferimento ai recettori Notch3 e Notch1, nell’ambito della risposta cellulare al trattamento con l’anti-TKI gefitinib.
RISULTATI. Abbiamo condotto i nostri studi utilizzando come modello sperimentale cellule di carcinoma mammario TN EGFR+ MDA-MB-468, sovra-esprimenti entrambe i recettori Notch3 e Notch1, e notoriamente resistenti agli anti-EGFR.
Abbiamo dimostrato che:
1. la sopravvivenza delle cellule TN è Notch3-dipendente piuttosto che Notch1-dipendente.
2. l’assenza di Notch3 (e non di Notch1) correla con un’evidente diminuzione della percentuale di cellule ciclanti e con una corrispondente modulazione di proteine coinvolte nella progressione nel ciclo cellulare (ciclina D1 e D3, p27).
3. l’assenza di Notch3 (e non di Notch1) correla con un’importante risensibilizzazione al gefitinib.
Questi dati dimostrano che i due recettori Notch possono svolgere funzioni diverse all’interno dello stesso contesto tumorale TN e suggeriscono la possibilità di un “crosstalk” differenziato con l’EGFR, con il quale abbiamo dimostrato che entrambe sono in grado di interagire direttamente.
Passo successivo è stato quindi quello di focalizzare la nostra attenzione sullo studio dell’asse Notch3-EGFR, al fine di identificare il meccanismo molecolare che sottointende la risensibilizzazione al farmaco osservata. Abbiamo quindi analizzato il possibile ruolo di Notch3 su meccanismi noti per favorire lo spegnimento del segnale del recettore EGFR.
In particolare, in seguito al silenziamento di Notch3, da solo o in combinazione con il gefitinib, abbiamo osservato:
4. un’importante riduzione dei livelli di fosforilazione dell’EGFR nel sito di auto-fosforilazione Y1173, notoriamente implicato nell’attivazione del signaling del recettore. In aggiunta, questo dato correla con una diminuita traslocazione nucleare dell’EGFR stesso, localizzazione generalmente associata ad un fenotipo tumorale più aggressivo.
5. una significativa internalizzazione dell’EGFR, di solito molto difficile da osservare nelle cellule MDA-MB-468 a causa degli elevati livelli d’espressione dello stesso recettore.
Questi dati suggeriscono un ruolo importante di Notch3, nel mantenimento persistente dell’EGFR a livello di membrana, in uno stato costitutivamente attivo, e quindi presumibilmente “pronto” per divenire rapidamente “targettabile” da agenti anti-EGFR nel momento in cui viene bloccato l’elemento fondamentale per la sopravvivenza di queste cellule, Notch3 appunto. Al contrario, risultati preliminari ci suggeriscono che l’assenza di Notch1 non comporta le stesse modificazioni funzionali dell’EGFR descritte nei punti 4 e 5, possibile ragione della mancanza di ri-sensibilizzazione al gefitinib osservata dopo silenziamento di Notch1 (punto 3).
Pertanto, sulla base dei dati finora ottenuti possiamo affermare che il recettore Notch3 (e non Notch1) è in grado di influenzare il “turnover” del recettore EGFR in cellule di tumori TN.
Dal punto di vista strettamente meccanicistico, il nostro punto di partenza è stato uno studio recente nel quale si dimostra che il recettore EGFR è preferenzialmente localizzato al livello dei rafts lipidici della membrana plasmatica di cellule di carcinoma mammario TN resistenti ai TKIs rispetto a quelle sensibili.
Abbiamo condotto studi iniziali a livello di questo particolare compartimento cellulare tramite esperimenti di isolamento biochimico e di immunofluorescenza. Abbiamo osservato una diversa localizzazione dei recettori Notch: se Notch3 è presente uniformemente nella membrana plasmatica, quindi sia a livello del compartimento rafts ma soprattutto in quello non-rafts, l’espressione di Notch1 in membrana sembra più esclusiva dei rafts, sovrapponendosi preferenzialmente con quella dell’EGFR stesso.
Questi risultati preliminari ottenuti ci suggeriscono che la diversa localizzazione dei recettori Notch, condivisa o meno con l’EGFR, possa rappresentare il presupposto per spiegare il diverso meccanismo molecolare che sottintende la comunicazione Notch3-EGFR (e Notch1-EGFR) nel contesto della sensibilità/resistenza al gefitinib, Ulteriori indagini saranno necessarie per validare questi risultati.
Seppur in corso di approfondimenti e di futura validazione in vivo, l’insieme dei risultati finora ottenuti e riportati nella presente tesi di Dottorato fornisce un valido supporto per l’identificazione di un nuovo marcatore molecolare, Notch3, associato con i meccanismi di resistenza agli inibitori anti-EGFR nei tumori mammari TN, che ad oggi trovano nell'insorgenza di resistenza al farmaco il principale ostacolo terapeutico. Lo scopo ultimo è quindi rappresentato dal potenziale sviluppo di nuove strategie di trattamento di tumori TN EGFR+Notch3+ che prevedano l’uso combinato di inibitori selettivi di Notch3 e farmaci anti-EGFR, ad oggi esclusi dalla pratica clinica dei tumori mammari (inclusi i TN) proprio per la scarsa risposta osservata nei “trials clinici”
