Lipase-catalysed synthesis of glycolipids - utilization of innovative media, reactors and substrates -

Glykolipide sind vielversprechende nichtionische Tenside mit einem breiten Anwendungsspektrum. Man begegnet ihnen täglich in Reinigungsmitteln, Pharmazeutika oder auch in Lebensmitteln. Aufgrund ihrer Vielseitigkeit und Präsenz in Hygieneprodukten steigt die Nachfrage weltweit kontinuierlich an. Die etablierte chemische Synthese von Glykolipiden weist einige Nachteile wie mangelnde Spezifität und Selektivität auf. Im Gegensatz zu den traditionellen Tensiden fossilen Ursprungs weisen sie nicht nur hervorragende Tensid- und Emulgiereigenschaften auf, sondern sind auch biologisch abbaubar und nicht toxisch für die Umwelt. Glykolipide können durch mikrobielle Fermentation, durch chemische oder enzymatische Synthese unter Verwendung erneuerbarer Ressourcen hergestellt werden. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir unter Verwendung von Lipasen, dass die Esterbildung unter milden und nahezu wasserfreien Bedingungen erreicht werden kann, wobei letztere erforderlich sind, um die Kondensation anstelle der Hydrolysereaktion zu begünstigen. So wurde unter Verwendung von Lösungsmitteln mit geringer Wasseraktivität der enzymatisch synthetisierte Zuckeralkoholester, Sorbitollaurat, als Modellprodukt verwendet. Folglich hebt diese Dissertation die enzymatische Synthese als Methode der Wahl für die maßgeschneiderte Herstellung einer potenziell breiten Palette von neuartigen Tensiden hervor. Die Biokatalyse ermöglichte eine innovative Herangehensweise an dieses aktuelle Thema mit einem multidisziplinären Ansatz im Hinblick auf die aktuellen Bedenken zur Nachhaltigkeit. Die Löslichkeit von Polyolen wie Zuckern oder Zuckeralkoholen in organischen Lösungsmitteln ist eher gering. Die enzymatische Synthese dieser Verbindungen ist jedoch in nahezu wasserfreien Medien unter Verwendung kostengünstiger und nachwachsender Rohstoffe möglich. Mit Hilfe von Lipasen kann die Esterbildung unter milden Bedingungen erreicht werden. Wir schlagen zunächst ein "2-in-1"-System vor, das die Löslichkeitsprobleme überwindet, da ein Deep Eutectic System (DES) aus Sorbitol und Cholinchlorid entweder ein rein organisches oder wässriges Medium ersetzt. Erstmals wurden 16 kommerziell erhältliche Lipase-Formulierungen verglichen und Faktoren, die den Umsatz beeinflussen, untersucht, um diesen Prozess dank einer neu entwickelten HPLC-ELSD-Methode zur Quantifizierung zu optimieren. So konnte bei der optimierten Synthese von Sorbitollaurat (SL) unter Verwendung von 50 g/L der Lipaseformulierung Novozym 435® bei 50°C eine 28%ige molare Umsetzung von 0,5 M Vinyllaurat zu seinem Zuckeralkoholmonoester erreicht werden, wenn das DES 5 Gew.-% Wasser enthielt. Nach 48h wurde das de novo synthetisierte Glykolipid durch Flüssig-Flüssig-Extraktion vom Medium abgetrennt, durch Flash-Chromatographie gereinigt und durch ein- und zweidimensionale Kernspinresonanz (NMR)-Experimente und Massenspektrometrie (MS) charakterisiert. Abschließend erbringen wir einen ersten Nachweis der Skalierbarkeit für diesen Prozess. Die Verwendung eines 2,5-L-Rührkesselreaktors (STR) ermöglichte eine Batch-Produktion bis zu 25 g/L in einem hochviskosen Zweiphasensystem. Dennoch bleiben viele Herausforderungen bestehen und begrenzen die Erwartungen an eine industrielle Anwendung. Eine lange Produktionszeit und relativ niedrige Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten gehören zu den Barrieren, die es zu überwinden gilt. Wir konzentrierten uns in diesem Zusammenhang auf die Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeiten und Ausbeuten bei der Herstellung von Sorbitollaurat durch eine mikrowellenunterstützte Methode, die wir jedoch mit einer konventionellen Heizmethode verglichen. Es wurden auch verschiedene Lösungsmittelsysteme miteinander konkurriert, wobei sich 2M2B als ein leistungsfähigeres Lösungsmittelsystem als das DES erwies. So erlaubte die Verwendung von 20 g/L immobilisierter Lipaseformulierung, 0,75 M Vinyllaurat, 0,25 M Sorbitol bei 50°C in 2M2B eine 92%ige Konversionsausbeute zu erreichen, was einer 168 g/L Titerproduktion entspricht. Der Einsatz der Mikrowellentechnologie ermöglichte danach eine 50-fache Steigerung der ursprünglichen Reaktionsgeschwindigkeit im organischen Lösungsmittel bei 75°C. Die Wiederverwendung des Biokatalysators wurde auch in 2M2B und DES untersucht, wobei bei letzterem eine größere Destabilisierung des Enzyms festgestellt wurde. Wir bringen somit eine Nuance in die intensive Entwicklung, die DESs derzeit in der Literatur als Medium für die Biokatalyse erfahren. Nichtsdestotrotz zeigen wir ermutigende Aussichten auf Verbesserungen, um DESs konkurrenzfähig zu Standardmedien für Biokonversionen zu machen. Abschließend untersuchten wir die Effizienz unseres Downstream-Prozesses, der die vollständige Rückgewinnung von Sorbitollaurat nach 4 Zyklen der Flüssig-Flüssig-Extraktion ermöglicht. Bestehende Berichte, die integrierte Prozesse zur Glykolipidproduktion aus nachwachsenden Rohstoffen beschreiben, verwenden viele Reaktionsschritte. Daher zielten wir darauf ab, das Verfahren zu vereinfachen. Durch die Verwendung von dielektrischer Mikrowellenerwärmung wurde die Herstellung von DESs zunächst erheblich beschleunigt. Unsere Vergleichsstudie ergab eine durchschnittlich 16-fach schnellere Vorbereitungszeit als die konventionelle Erhitzungsmethode in einem Inkubator. Darüber hinaus konnten Lipide aus robuster ölhaltiger Hefe-Biomasse erfolgreich bis zu 70% extrahiert werden, ohne die Vorbehandlungsmethode für den Zellaufschluss zu verwenden, wodurch der für einen solchen Prozess notwendigen Energieaufwand begrenzt. Angesäuerte DESs, die entweder aus Xylit oder Sorbit und Cholinchlorid bestanden, vermittelten den Eintopfprozess und ermöglichten die anschließende Umwandlung der Lipide in monoacylierte Palmitat-, Oleat-, Linoleat- und Stearat-Zuckeralkoholester. Somit zeigen wir, dass die Zugabe von immobilisierter Candida antarctica Lipase B (Novozym 435®) in einer angesäuerten DES-Mischung eine vereinfachte und schnelle Glykolipidsynthese unter Verwendung direkt ölhaltiger Hefebiomasse ermöglicht. Schließlich stellen wir fest, dass der DES-ähnliche Manuka-Honig auch als Medium für die Glykolipidsynthese dienen kann. Diese übersättigte Zuckerlösung kann in Bezug auf die physikochemischen Eigenschaften mit den zuckerbasierten DESs verglichen werden. Da Honigprodukte für therapeutische Zwecke kommerziell verfügbar sind, erscheint es interessant, ihre Bioaktivität zu erhöhen. Im letzten Kapitel dieser Dissertation wird untersucht, ob die Anreicherung von medizinischem Honig mit in situ enzymatisch synthetisierten Glykolipiden die antimikrobielle Eigenschaft der Mischung verbessern kann. Die getesteten Mischungen bestehen aus Manuka-Honig, der mit Octanoat-, Decanoat-, Laurat- und Myristat-Zuckerestern angereichert ist, die jeweils als GOH, GDH, GLH und GMH bezeichnet werden. Um die Bioaktivität dieser Mischungen zu charakterisieren, wurde zunächst ein qualitatives Screening mittels Agar-Well-Diffusionstest mit Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida bombicola, Escherichia coli und Pseudomonas putida durchgeführt, das eine deutlich erhöhte Empfindlichkeit dieser Mikroorganismen gegenüber den verschiedenen mit Glykolipiden angereicherten Honigmischungen bestätigte. Dann wurde ein entworfener Biosensor E. coli-Stamm verwendet, der ein Stressreportersystem aufweist, das aus drei stressspezifisch induzierbaren, rot, grün und blau fluoreszierenden Proteinen besteht, die jeweils physiologischen Stress, Genotoxizität und Zytotoxizität übersetzen. Letzteres ermöglichte die Charakterisierung der Bioaktivität und zeigte eine sechsfache Steigerung des physiologischen Stresses durch GOH im Vergleich zu regulärem Manuka-Honig bei einer Konzentration von 1,6% (v/v). Der antibakterielle Agar-Well-Diffusionstest mit E. coli wurde dann durchgeführt und zeigte ein verbessertes hemmendes Potential mit GOH bei 20% (v/v) Konzentration

Continuous Flow Glycolipid Synthesis Using a Packed Bed Reactor

Glycolipids are a class of biodegradable biosurfactants that are non-toxic and based on renewables, making them a sustainable alternative to petrochemical surfactants. Enzymatic synthesis allows a tailor-made production of these versatile compounds using sugar and fatty acid building blocks with rationalized structures for targeted applications. Therefore, glycolipids can be comprehensively designed to outcompete conventional surfactants regarding their physicochemical properties. However, enzymatic glycolipid processes are struggling with both sugars and fatty acid solubilities in reaction media. Thus, continuous flow processes represent a powerful tool in designing efficient syntheses of sugar esters. In this study, a continuous enzymatic glycolipid production catalyzed by Novozyme 435® is presented as an unprecedented concept. A biphasic aqueous–organic system was investigated, allowing for the simultaneous solubilization of sugars and fatty acids. Owing to phase separation, the remaining non-acylated glucose was easily separated from the product stream and was refed to the reactor forming a closed-loop system. Productivity in the continuous process was higher compared to a batch one, with space–time yields of up to 1228 ± 65 µmol/L/h. A temperature of 70 °C resulted in the highest glucose-6-O-decanoate concentration in the Packed Bed Reactor (PBR). Consequently, the design of a continuous biocatalytic production is a step towards a more competitive glycolipid synthesis in the aim for industrialization

Synthesis of (S)- and (R)-β-Tyrosine by Redesigned Phenylalanine Aminomutase

Phenylalanine aminomutase from Taxus chinensis (TchPAM) is employed in the biosynthesis of the widely used antitumor drug paclitaxel. TchPAM has received substantial attention due to its strict enantioselectivity towards (R)-β-phenylalanine, in contrast to the bacterial enzymes classified as EC 5.4.3.11 which are (S)-selective for this substrate. However, the understanding of the isomerization mechanism of the reorientation and rearrangement reactions in TchPAM might support and promote further research on expanding the scope of the substrate and thus the establishment of large-scale production of potential synthesis for drug development. Upon conservation analysis, computational simulation, and mutagenesis experiments, we report a mutant from TchPAM, which can catalyze the amination reaction of trans-p-hydroxycinnamic acid to (R)- and (S)-β-tyrosine. We propose a mechanism for the function of the highly conserved residues L179, N458, and Q459 in the active site of TchPAM. This work highlights the importance of the hydrophobic residues in the active site, including the residues L104, L108, and I431, for maintaining the strict enantioselectivity of TchPAM, and the importance of these residues for substrate specificity and activation by altering the substrate binding position or varying the location of neighboring residues. Furthermore, an explanation of (R)-selectivity in TchPAM is proposed based on the mutagenesis study of these hydrophobic residues. In summary, these studies support the future exploitation of the rational engineering of corresponding enzymes with MIO moiety (3,5-dihydro-5-methylidene-4H-imidazole-4-one) such as ammonia lyases and aminomutases of aromatic amino acids

Computational-designed enzyme for β-tyrosine production in lignin valorization

Lignin is an underutilized sustainable source of aromatic compounds. To valorize the low-value lignin monomers, we proposed an efficient strategy, involving enzymatic conversion from trans-p-hydroxycinnamic acids to generate valued-added canonical and non-canonical aromatic amino acids. Among them, β-amino acids are recognized as building blocks for bioactive natural products and pharmaceutical ingredients due to their attractive antitumor properties. Using computational enzyme design, the (R)-β-selective phenylalanine aminomutase from Taxus chinensis (TchPAM) was successfully mutated to accept β-tyrosine as the substrate, as well as to generate the (R)-β-tyrosine with excellent enantiopurity (ee > 99%) as the unique product from trans-p-hydroxycinnamic acid. Moreover, the kinetic parameters were determined for the reaction of four Y424 enzyme variants with the synthesis of different phenylalanine and tyrosine enantiomers. In the ammonia elimination reaction of (R)-β-tyrosine, the variants Y424N and Y424C displayed a two-fold increased catalytic efficiency of the wild type. In this work, a binding pocket in the active site, including Y424, K427, I431, and E455, was examined for its influence on the β-enantioselectivity of this enzyme family. Combining the upstream lignin depolymerization and downstream production, a sustainable value chain based on lignin is enabled. In summary, we report a β-tyrosine synthesis process from a monolignol component, offering a new way for lignin valorization by biocatalyst modification

Microwave-Assisted One-Pot Lipid Extraction and Glycolipid Production from Oleaginous Yeast Saitozyma podzolica in Sugar Alcohol-Based Media

Glycolipids are non-ionic surfactants occurring in numerous products of daily life. Due to their surface-activity, emulsifying properties, and foaming abilities, they can be applied in food, cosmetics, and pharmaceuticals. Enzymatic synthesis of glycolipids based on carbohydrates and free fatty acids or esters is often catalyzed using certain acyltransferases in reaction media of low water activity, e.g., organic solvents or notably Deep Eutectic Systems (DESs). Existing reports describing integrated processes for glycolipid production from renewables use many reaction steps, therefore this study aims at simplifying the procedure. By using microwave dielectric heating, DESs preparation was first accelerated considerably. A comparative study revealed a preparation time on average 16-fold faster than the conventional heating method in an incubator. Furthermore, lipids from robust oleaginous yeast biomass were successfully extracted up to 70% without using the pre-treatment method for cell disruption, limiting logically the energy input necessary for such process. Acidified DESs consisting of either xylitol or sorbitol and choline chloride mediated the one-pot process, allowing subsequent conversion of the lipids into mono-acylated palmitate, oleate, linoleate, and stearate sugar alcohol esters. Thus, we show strong evidence that addition of immobilized Candida antarctica Lipase B (Novozym 435®), in acidified DES mixture, enables a simplified and fast glycolipid synthesis using directly oleaginous yeast biomass

Lipase-Catalyzed Production of Sorbitol Laurate in a “2-in-1” Deep Eutectic System: Factors Affecting the Synthesis and Scalability

Surfactants, such as glycolipids, are specialty compounds that can be encountered daily in cleaning agents, pharmaceuticals or even in food. Due to their wide range of applications and, more notably, their presence in hygiene products, the demand is continuously increasing worldwide. The established chemical synthesis of glycolipids presents several disadvantages, such as lack of specificity and selectivity. Moreover, the solubility of polyols, such as sugars or sugar alcohols, in organic solvents is rather low. The enzymatic synthesis of these compounds is, however, possible in nearly water-free media using inexpensive and renewable building blocks. Using lipases, ester formation can be achieved under mild conditions. We propose, herein, a “2-in-1” system that overcomes solubility problems, as a Deep Eutectic System (DES) made of sorbitol and choline chloride replaces either a purely organic or aqueous medium. For the first time, 16 commercially available lipase formulations were compared, and the factors affecting the conversion were investigated to optimize this process, owing to a newly developed High-Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detector (HPLC-ELSD) method for quantification. Thus, using 50 g/L of lipase formulation Novozym 435® at 50 °C, the optimized synthesis of sorbitol laurate (SL) allowed to achieve 28% molar conversion of 0.5 M of vinyl laurate to its sugar alcohol monoester when the DES contained 5 wt.% water. After 48h, the de novo synthesized glycolipid was separated from the media by liquid–liquid extraction, purified by flash-chromatography and characterized thoroughly by one- and two-dimensional Nuclear Magnetic Resonance (NMR) experiments combined to Mass Spectrometry (MS). In completion, we provide initial proof of scalability for this process. Using a 2.5 L stirred tank reactor (STR) allowed a batch production reaching 25 g/L in a highly viscous two-phase system

Enzymatic Synthesis of Alkyl Glucosides by β‐Glucosidases in a 2‐in‐1 Deep Eutectic Solvent System

Alkyl glycosides are biodegradable surfactants with excellent physico-chemical properties. Although their wide-range application is considered ecofriendly, their synthesis is not due to the need for toxic organic solvents and corrosive acids as catalysts. Moreover, chemical synthesis results in complex mixtures rather than defined compounds. To overcome both disadvantages as well as the limited solubility of sugars in organic solvents, a highly selective enzymatic synthesis was set up with a β-glucosidase condensing D-glucose and different fatty alcohols in a deep eutectic solvent

Enhanced Bioactivity of Tailor-Made Glycolipid Enriched Manuka Honey

Glycolipids can be synthetized in deep eutectic solvents (DESs) as they possess low water content allowing a reversed lipase activity and thus enables ester formation. Based on this principle, honey can also serve as a media for glycolipid synthesis. Indeed, this supersaturated sugar solution is comparable in terms of physicochemical properties to the sugar-based DESs. Honey-based products being commercially available for therapeutic applications, it appears interesting to enhance its bioactivity. In the current work, we investigate if enriching medical grade honey with in situ enzymatically-synthetized glycolipids can improve the antimicrobial property of the mixture. The tested mixtures are composed of Manuka honey that is enriched with octanoate, decanoate, laurate, and myristate sugar esters, respectively dubbed GOH, GDH, GLH, and GMH. To characterize the bioactivity of those mixtures, first a qualitative screening using an agar well diffusion assay has been performed with methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida bombicola, Escherichia coli, and Pseudomonas putida which confirmed considerably enhanced susceptibility of these micro-organisms to the different glycolipid enriched honey mixtures. Then, a designed biosensor E. coli strain that displays a stress reporter system consisting of three stress-specific inducible, red, green, and blue fluorescent proteins which respectively translate to physiological stress, genotoxicity, and cytotoxicity was used. Bioactivity was, therefore, characterized, and a six-fold enhancement of the physiological stress that was caused by GOH compared to regular Manuka honey at a 1.6% (v/v) concentration was observed. An antibacterial agar well diffusion assay with E. coli was performed as well and demonstrated an improved inhibitory potential with GOH upon 20% (v/v) concentration

Application of deep eutectic solvents in protein extraction and purification

Deep eutectic solvents (DESs) are a mixture of hydrogen bond donor (HBD) and hydrogen bond acceptor (HBA) molecules that can consist, respectively, of natural plant metabolites such as sugars, carboxylic acids, amino acids, and ionic molecules, which are for the vast majority ammonium salts. Media such as DESs are modular tools of sustainability that can be pointed toward the extraction of bioactive molecules due to their excellent physicochemical properties, their relatively low price, and accessibility. The present review focuses on the application of DESs for protein extraction and purification. The in-depth effects and principles that apply to DES-mediated extraction using various renewable biomasses will be discussed as well. One of the most important observations being made is that DESs have a clear ability to maintain the biological and/or functional activity of the extracted proteins, as well as increase their stability compared to traditional solvents. They demonstrate true potential for a reproducible but more importantly, scalable protein extraction and purification compared to traditional methods while enabling waste valorization in some particular cases

Identification of novel bioactive proteins and their produced oligopeptides from Torreya grandis nuts using proteomic based prediction

Torreya grandis nut is a chief functional food in China consumed for centuries. Besides its rich protein composition, increasing studies are now focusing on T. grandis functional proteins that have not yet identified. In this study, liquid chromatography coupled with mass spectrometry detection of smaller and major proteins, revealed that the major peptide was 36935.00 Da. Proteome sequencing annotated 142 proteins in total. Bioactive proteins such as defensin 4 was annotated and its anti-microbial function was verified. Finally, functional oligopeptides were predicted by searching sequences of digested peptides in databases. Ten group of oligopeptides were suggested to exhibit antioxidant, Angiotensin-converting enzyme inhibition, anti-inflammatory. The predicted antioxidant activity was experimentally validated. It is interesting that a peptide GYCVSDNN digested from defensin 4 showed antioxidant activity. This study reports novel functional peptides from T. grandis nuts that have not been isolated and/or included as functional ingredients in nutraceuticals and in food industry