Analyse de l'efficacité de la régulation par les microARN

Les microARN constituent une classe de petits ARN non codants d une vingtaine de nucléotides, issus de transcrits cellulaires, qui inhibent l expression de gènes cibles au niveau post-transcriptionnel. Chez les mammifères, bien qu ils puissent agir sur une cible parfaitement complémentaire (mode parfait), les microARN ont presqu exclusivement des cibles partiellement complémentaires (mode imparfait). Puisqu en mode imparfait une coupure endonucléolytique de la cible est impossible, il est généralement proposé que le mode imparfait soit moins efficace que le mode parfait : conduisant à un silencing moins efficace, nécessitant plus de complexes effecteurs (miRISC) et facilement saturable par une augmentation du nombre de cible. Dans ce travail j ai développé une approche expérimentale reposant sur l expression de protéines fluorescentes pour mesurer précisément le silencing au niveau de chaque cellule. J ai fait trois observations inattendues sur l efficacité de la régulation par les microARN : i) le silencing en mode parfait et imparfait nécessite des quantités similaires de petit ARN, ii) une augmentation, même très importante, de l expression du gène cible ne lui permet pas d échapper à la régulation, iii) le silencing n est pas intrinsèquement plus faible en mode imparfait (qu en mode parfait) mais n est pas actif dans toutes les cellules. Si les deux premiers points sont facilement explicables dans le cadre de l induction de la dégradation de l ARNm cible sur un mode catalytique via la déadénylation de l ARNm, le troisième indique l existence d une régulation forte du silencing qui est spécifique du mode imparfait. De plus, comme dans les deux modes le silencing dépend principalement du même partenaire, Ago2, cette régulation intervient après l assemblage du complexe minimal (Ago2/petit ARN). Ainsi, les différences entre les modes parfait et imparfait ne se situent pas au niveau proposé puisque lorsque la cellule est compétente, leurs efficacités sont comparables. Par contre, mes travaux mettent en évidence l existence d un contrôle de la régulation en mode imparfait dont la nature reste à préciser.MicroRNAs are endogenous small non-coding RNAs about 21 nucleotides in length that inhibit the expression of target genes primarily at the post-transcriptional level. The target recognition of microARN is sequence-specific and requires a partial complementarity between the microRNA and target sequences that are present on the mRNA molecules. microRNAs are part of an effector complex, miRISC, containing multiple proteins which can participate to a repression of translation and/or promotes destabilization of the target mRNA. The mechanism of microRNA silencing is not completely understood to date, but it is assumed that it is globally less potent than that of siRNA acting on perfect targets. By using fluorescent proteins expressing reporter plasmids and flow cytometry, we observed an efficient silencing by microRNA which does not require more active complexes than the perfect target silencing and cannot be easily saturated. This suggests that in cells in culture, microRNA silencing works in a catalytic manner leading to mRNA degradation. In addition, our data also indicates that the efficiency of microRNA silencing is variable among cells and can be almost completely abrogated under some conditions contrary to the siRNA silencing which is active in all cells. As we observed that the protein Ago2 is the only member of Ago family that is implicated in the microRNA silencing, it follows that the regulation of microRNA silencing acts after the formation of the core complex (Ago2/small RNA). So the difference between the silencing in the perfect and imperfect mode are not what is usually proposed, but pertain to a level of cellular control, which remains to be deciphered.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Induction de l'expression génique par des petits ARN dans des cellules de mammifère

Chez la plupart des eucaryotes, la présence d ARN double brin induit la mise en place de mécanismes qui peuvent inhiber l expression de gènes sur la base d une complémentarité de séquence. L exemple le mieux connu est le cas de l interférence par l ARN telle qu elle a été décrite initialement chez C. elegans, où les ARN double brin génèrent une endonucléase spécifique de séquence qui dégrade tout ARN parfaitement complémentaire du petit ARN guide contenu dans le complexe RISC. En plus de cette activité post-transcriptionnelle, il a été observé chez de nombreux eucaryotes l existence de mécanismes apparentés à l interférence par l ARN et qui inhibent la transcription en agissant au niveau de la chromatine. Si ces mécanismes ont été clairement mis en évidence chez les plantes et les champignons il n existe que quelques exemples de ce type de régulation chez les mammifères. De manière inattendue, le fait de cibler le promoteur d un gène avec de petits ARN double brin peut conduire à une augmentation de son expression. Cette réponse paradoxale n a été observée jusqu à présent que dans des cellules de mammifère, et si elle suscite un intérêt en particulier pour stimuler l expression de gènes suppresseurs de tumeurs, son mécanisme est encore inconnu.Mes travaux ont porté sur l étude de l induction de l expression par des petits ARN. Ils reposent tout d abord sur le développement d une approche expérimentale qui permet de suivre l activité du promoteur du gène ciblé. Pour cela, j ai utilisé des constructions indicatrices organisées autour d un promoteur bidirectionnel qui contrôle l expression de deux protéines fluorescentes. Lorsque l on cible le messager de l une de ces protéines, l expression de l autre est augmentée et j ai pu montrer que ceci corrèle avec la quantité d ARN messager et de polymérase II présente sur le promoteur bidirectionnel. Ainsi, l utilisation d un promoteur bidirectionnel permet effectivement de suivre le niveau de transcription du gène ciblé par le petit ARN.Cette induction de l expression détectée de manière controlatérale n est pas due à un effet hors cible des petits ARN car elle nécessite la présence de la séquence cible sur l un des transcrits de la construction indicatrice. L induction peut être observée avec de nombreux petits ARN différents, y compris s ils interagissent comme des micro ARN. Les constructions indicatrices que j ai développées sont donc biaisées en faveur d une réponse de type induction transcriptionnelle enréponse à un silencing. L utilisation d un promoteur bidirectionnel est probablement à l origine de ce biais à travers la possibilité d induire une transcription convergente sur les plasmides lorsqu ils sont circulaires. De fait, la linéarisation de la construction indicatrice supprime l induction, du moins pour les constructions les plus simples.Si le coeur du complexe RISC, la protéine Ago2, est nécessaire au silencing et à l induction, j ai pu montrer que dans le deuxième cas c était en fait pour guider le complexe RISC sur les transcrits et non pas pour les couper. En effet, le silencing des protéines TNRC6A et B diminue fortement l induction sans toucher au silencing s il procède en mode siRNA. De plus l ancrage sur le transcrit EGFP induit une réponse de même type que le petit ARN (silencing et induction). Cette approche d ancrage m a permis d identifier les domaines nécessaires au silencing et à l induction et de montrer qu ils sont distincts.Ce travail permet donc de mettre en évidence que l induction transcriptionnelle observée sur nos constructions indicatrices est due à une activité des partenaires des protéines Argonaute, la famille GW182/TNRC6. Cette observation ouvre la voie à une caractérisation du mécanisme de cette induction en montrant qu elle relève d une activité spécifique du complexe RISC.In the majority of the eucaryote, the presence of double-strands RNA induce the inhibition of gene expression base on the complementary of sequence. The best known example is the case of RNA interference in C. elegans which is the first model described, in which the double-strands RNA generate an specific endonuclease who degrade all RNA complementary perfectly to the small RNA guide included in the complex RISC. In addition to this post-transcriptional activity, it has been observed in many eukaryotes the existence of mechanisms related to RNA interference and it inhibit transcription by acting at the chromatin. If these mechanisms have been clearly demonstrated in plants, fungi, there are only several examples of this type of regulation in mammals. Unexpectedly, the targeting the promoter of a gene with small double-stranded RNA can lead to increased expression. This paradoxical response has not been observed so far in mammalian cells, but it raises interest particularly to stimulate the expression of tumor suppressor genes, unfortunely the mechanism is still unknown.My work has focused on studying the induction of expression by small RNAs. They are based first on the development of an experimental approach that allows to monitor the promoter activity of the targeted gene. To do this I used indicator constructions organized around a bidirectional promoter that controls the expression of two fluorescent proteins. When targeting the messenger of one of these proteins, the expression of the other is increased and I was able to show that thisincrease correlates with the amount of RNA messenger polymerase II presented on the bidirectional promoter. Thus, the use of a bidirectional promoter can effectively monitor the level of transcription of the gene targeted by the small RNA. This induction of expression detected in a "contralateral" is not due to an off-target effect of siRNA because it requires the presence of the target sequence on one of the transcripts of the construction indicator. The induction can be observed with many different small RNAs, including the interact as micro RNA. Thus the construction indicator that I developed are biased in an induction response transcriptionally in response to a silencing. The use of a bidirectional promoter is probably the origin of this bias through the possibility of inducing a convergent transcription when the plasmids are circular. In fact, the linearization of the construction indicator removes the induction, at least for the simplest constructions. If the heart of the complex RISC is the protein Ago2, is necessary for the silencing and the induction, I was able to show that in the second case Ago2 was in fact to guide the RISC complex on the transcripts but not to cut it. Indeed, the silencing of proteins TNRC6A and B reduces induction significantly without affecting the silencing if it processe in the siRNA model. Also anchoring the transcript EGFP induces a response similar to the small RNA (silencing and induction). This anchor approach allowed me to identify domaines necessary for silencing and induction and show that they are distinct. This work makes it possible to demonstrate that the transcriptional induction observed in our constructions indicator is due to a activity partner ofArgonaute proteins, the GW182/TNRC6 family. This observation open the way for characterization of the mechanism of this induction by showing that it belongs to a specific activity of the RISC complex.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

High frequency trans-splicing in a cell line producing spliced and polyadenylated RNA polymerase I transcripts from an rDNA-myc chimeric gene

The 2G1MycP2Tu1 cell line was obtained following transfection of human colon carcinoma cells from the SW613-S cell line with a plasmid carrying a genomic copy of the human MYC gene. 2G1MycP2Tu1 cells produce MYC mRNAs and proteins of abnormal size. In order to analyze the structure of these abnormal products, a cDNA library constructed using RNA isolated from these cells was screened with a MYC probe. Fifty clones were studied by DNA sequencing. The results indicated that a truncated copy of the MYC gene had integrated into an rDNA transcription unit in 2G1MycP2Tu1 cells. This was confirmed by northern blot analysis, PCR amplification on genomic DNA and fluorescent in situ hybridization (FISH) experiments on metaphase chromosomes. 2G1MycP2Tu1 cells produce hybrid rRNA-MYC RNA molecules that are polyadenylated and processed by splicing reactions involving natural and cryptic splice sites. These transcripts are synthesized by RNA polymerase I, as confirmed by actinomycin D sensitivity experiments, suggesting that 3′ end processing and splicing are uncoupled from transcription in this case. 2G1MycP2Tu1 cells also produce another type of chimeric mRNAs consisting of correctly spliced exons 2 and 3 of the MYC gene fused to one or more extraneous 5′ exons by proper splicing to the acceptor sites of MYC exon 2. These foreign exons belong to 33 different genes, which are located on 14 different chromosomes. These observations and the results of FISH and Southern blotting experiments lead us to conclude that trans-splicing events occur at high frequency in 2G1MycP2Tu1 cells

mRNP3 and mRNP4 are phosphorylatable by casein kinase II in Xenopus oocytes, but phosphorylation does not modify RNA-binding affinity

AbstractmRNP3 and mRNP4 (also called FRGY2) are two mRNA-binding proteins which are major constituents of the maternal RNA storage particles of Xenopus laevis oocytes. The phosphorylation of mRNP3–4 has been implicated in the regulation of mRNA masking. In this study, we have investigated their phosphorylation by casein kinase II and its consequence on their affinity for RNA. Comparison of the phosphopeptide map of mRNP3–4 phosphorylated in vivo with that obtained after phosphorylation in vitro by purified Xenopus laevis casein kinase II strongly suggests that casein kinase II is responsible for the in vivo phosphorylation of mRNP3–4 in oocytes. The phosphorylation occurs on a serine residue in a central domain of the proteins. The affinity of mRNP3–4 for RNA substrates remained unchanged after the treatment with casein kinase II or calf intestine phosphatase in vitro. This suggests that phosphorylation of these proteins does not regulate their interaction with RNA but rather controls their interactions with other proteins

Introduction : Les régulations par les petits ARN

L'ARN a pendant longtemps été cantonné à un rôle d'intermédiaire passif entre l'ADN porteur de l'information génétique et les protéines qui, dans la plupart des cas, mettent en œuvre cette information. Pourtant les molécules d'ADN et d'ARN peuvent s'hybrider ce qui ouvre la possibilité de nombreuses interactions entre les gènes et leurs transcrits et, en particulier, de rétrocontrôles. Au cours des dix dernières années un ensemble de travaux a mis en évidence que de telles régulations existaient effectivement chez les eucaryotes même si le schéma n'est pas exactement celui que l'on aurait pu prédire. Des ARN jouent ainsi un rôle essentiel dans la régulation de la traduction et de la dégradation des ARN messagers dans le cadre de l'interférence par l'ARN et des phénomènes apparentés. Deux éléments distinguent ces ARN régulateurs : leur taille (une vingtaine de nucléotides) et le fait qu'à un moment de leur genèse ils ont été des ARN double brin. Le champ des activités biologiques de ces petits ARN est toutefois beaucoup plus vaste que celui des ARN messagers et s'étend aussi à l'organisation du génome à travers le contrôle de la compaction de la chromatine, les réarrangements de gènes ou l'organisation spatiale du noyau. Ainsi des petits ARN interviennent-ils sur tous les niveaux de l'expression génique et sont-ils au centre des régulations cellulaires chez les eucaryotes

Induction of tumor necrosis factor-alpha and -beta and interferon-gamma mRNA by interleukin 2 in murine lymphocytic cell lines

International audienc

Regulation of pim and myb mRNA accumulation by interleukin 2 and interleukin 3 in murine hematopoietic cell lines.

International audienceWe have studied the mRNA accumulation of pim and myb genes in two interleukin 2- (IL2-)dependent, CTLL-2 and B6.1, and one IL3-dependent, FDC-P2, murine hematopoietic cell lines. To be able to dissociate the IL2 response from the phenomenon of lymphocyte activation, we used cell lines constitutively expressing the high affinity IL2 receptor. Deprivation of IL2 for 16 h led to an accumulation of CTLL-2 cells in G0/G1, and stimulation with IL2 induced a progression in S phase after 10 h. An increased accumulation of pim mRNA was observed in all cases in response to IL2 or IL3. This regulation did not require de novo protein synthesis and was, in CTLL-2 cells, mostly at the transcriptional level. Expression of myb was more complex: in CTLL-2 and FDC-P2 it is high and constitutive, while in B6.1 it is low and induced by IL2. This difference in myb regulation correlates with the higher level of myb expression in immature cells, as only B6.1 is functionally mature. Furthermore, it shows that transcription of myb does not affect the control of the cell cycle by the growth factors IL2 and IL3. These studies demonstrate that pim belongs to the small group of protooncogenes that can be induced during the primary response to growth factors (fos, myc, and myb) and that constitutive expression of myb, at least at the RNA level, is not sufficient to abrogate the growth factor requirement of hematopoietic cell lines

Analyse cinétique de l'interférence par l'ARN dans les compartiments nucléaire et cytoplasmique des cellules de mammifères

LE KREMLIN-B.- PARIS 11-BU Méd (940432101) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF