Screening of protein kinase inhibitors identifies PKC inhibitors as inhibitors of osteoclastic acid secretion and bone resorption

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Bone resorption is initiated by osteoclastic acidification of the resorption lacunae. This process is mediated by secretion of protons through the V-ATPase and chloride through the chloride antiporter ClC-7. To shed light on the intracellular signalling controlling extracellular acidification, we screened a protein kinase inhibitor library in human osteoclasts.</p> <p>Methods</p> <p>Human osteoclasts were generated from CD14+ monocytes. The effect of different kinase inhibitors on lysosomal acidification in human osteoclasts was investigated using acridine orange for different incubation times (45 minutes, 4 and 24 hours). The inhibitors were tested in an acid influx assay using microsomes isolated from human osteoclasts. Bone resorption by human osteoclasts on bone slices was measured by calcium release. Cell viability was measured using AlamarBlue.</p> <p>Results</p> <p>Of the 51 compounds investigated only few inhibitors were positive in both acidification and resorption assays. Rottlerin, GF109203X, Hypericin and Ro31-8220 inhibited acid influx in microsomes and bone resorption, while Sphingosine and Palmitoyl-DL-carnitine-Cl showed low levels of inhibition. Rottlerin inhibited lysosomal acidification in human osteoclasts potently.</p> <p>Conclusions</p> <p>In conclusion, a group of inhibitors all indicated to inhibit PKC reduced acidification in human osteoclasts, and thereby bone resorption, indicating that acid secretion by osteoclasts may be specifically regulated by PKC in osteoclasts.</p

Environmental risk limits for carbendazim

Dit rapport geeft milieurisicogrenzen voor het fungicide carbendazim in water. Milieurisicogrenzen zijn de technisch-wetenschappelijke advieswaarden voor de uiteindelijke milieukwaliteitsnormen in Nederland. De milieurisicogrenzen zijn afgeleid volgens de methodiek die is voorgeschreven in de Europese Kaderrichtlijn Water.VRO

Internationale activiteiten gericht op het verminderen van LC50 testen voor het vaststellen van acute toxiciteit in vissen : International efforts to reduce the use of acute toxicity tests in fish

Om de veiligheid van stoffen voor het milieu te beoordelen is informatie nodig over de mate waarin stoffen giftig zijn. Deze informatie wordt gedeeltelijk via dierproeven verkregen, zoals in vissen. Om zo min mogelijk dierproeven in te hoeven zetten, wordt gezocht naar alternatieven. In dat verband heeft het RIVM in kaart gebracht welke internationale activiteiten zijn ondernomen om het proefdiergebruik te verminderen voor studies naar de acute giftigheid van chemische stoffen voor vissen. Op dit moment vinden de meeste activiteiten hiervoor plaats bij de OESO (Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling) die zorgt voor uniforme testrichtlijnen en bij ECHA (Europees Agentschap voor Chemische Stoffen) in het kader van de Europese stoffenwetgeving REACH. Bij de acute giftigheidstesten voor vissen wordt gezocht bij welke concentratie 50 procent van de vissen sterft (zogeheten LC50-methode). Deze testen zijn in principe verboden, omdat de dieren veel ongerief ondervinden. Ze worden alleen met ontheffing ingezet als er geen alternatieve methoden mogelijk zijn. Een van de alternatieven is om visembryo's voor deze test te gebruiken; een methode die is geaccepteerd door de OESO en onder bepaalde condities voor REACH mag worden gebruikt. Visembryo's worden tot vijf dagen na bevruchting niet als proefdier aangemerkt, omdat ze dan nog niet zelfstandig kunnen eten en geen pijn en ongerief kunnen ervaren. Implementatie van deze test in de wettelijke richtlijnen kan het proefdiergebruik verminderen. Het is niet mogelijk dierproeven hiermee volledig te vervangen, doordat het gebruik van vissenembryo's niet voor alle (klassen van) chemische stoffen geschikt is. De OESO schrijft nu nog meerdere concentraties voor in de test met volwassen vissen. Het aantal proefdieren kan ook worden verminderd door de huidige test uit te voeren met één concentratie van de stof. Hiervoor wordt bij de OESO momenteel een strategie ontwikkeld.In order to assess the environmental safety of chemical substances, information must be obtained about their toxicity. Such information is partly derived tests performed in animals. Researchers are currently looking for alternative methods to reduce the reliance on animal testing. The Dutch National Institute for Public Health and the Environment (RIVM) has surveyed international efforts to reduce the number of animals in studies examining the acute toxicity of chemical substances to fish. At present, most activities in this area are being undertaken under the auspices of the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), who develop harmonized test guidelines and the European Chemicals Agency (ECHA) for REACH (Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals). Acute toxicity tests in fish seek to determine the concentration at which 50 percent of the fish die (the so-called 'LC50 test'). In principle, such tests are prohibited because of their large impact on animal welfare. They may only be performed under an exemption when no alternative research methods are available. One alternative is to use fish embryos for this toxicity test. This method has been authorized by the OECD and can be used for REACH purposes. Fish embryos up to five days after fertilization do not fall into the regulatory frameworks dealing with animal experimentation. One reason is that in this early life stage the embryos cannot eat independently or experience pain or discomfort. Implementation of the Fish Embryo Toxicity (FET) tests in the applicable regulatory guidelines may therefore reduce the number of experimental animals for acute toxicity testing. However, FET tests cannot completely replace animal testing because they are not suitable for all (classes of) chemical substances. The OECD guideline currently prescribes multiple concentrations in the fish acute toxicity test. The number of test animals used can also be reduced by performing acute toxicity tests in fish using a single concentration of the substance being studied. The OECD is currently developing a strategy for this.Ministerie van E