Knockdown of the circular RNA circARID1A induces differentiation and apoptosis in neuroblastoma cell lines

Hintergrund: Zirkuläre RNAs (circRNAs) bilden eine Klasse nicht-kodierender RNAs, die durch alternatives Spleißen, dem sogenannten Backsplicing entstehen und an der Regulation von Genexpression beteiligt sind. Sie werden während der neuralen Differenzierung differenziell exprimiert und sind in vielen Tumorentitäten fehlreguliert. Das Neuroblastom entsteht aus Vorläuferzellen der Neuralleiste und ist der häufigste extrakranielle Tumor des Kindesalters. Zum Zeitpunkt der Diagnose präsentieren sich ca. 50% der Kinder mit einer Hochrisikokonstellation, was mit einer schlechten Prognose einhergeht. Durch RNA Sequenzierung von 104 primären Neuroblastomen konnten 5171 circRNAs identifiziert werden. Hierunter befand sich circARID1A, welche verglichen mit anderen Tumorentitäten und gesunden neuralem Gewebe besonders hoch im Neuroblastom exprimiert wird und in dieser Arbeit funktionell charakterisiert wird. Methoden: Eine Auswahl von sieben circRNA Kandidaten wurde in Neuroblastom Zelllinien durch qRT-PCR, Sanger Sequenzierung und ein RNase-R-Assay validiert. Ein Northern Blot diente der weiteren Validierung von circARID1A. Die Expression von mRNAs und circRNAs wurden mittels qRT-PCR in 11 verschiedenen Neuroblastom Zelllinien analysiert. Durch Knockdown Experimente mittels siRNA wurde der Einfluss von circARD1A auf Zellzahlen, Zellviabilität, Proliferation, Apoptose und Differenzierung in den Neuroblastom Zelllinien SHSY5Y und IMR-5 untersuch. Anschließend wurde ein induzierbares Überexpressionsmodell in der Zelllinie SH-EP generiert und ein Rescue Experiment in SH-SY5Y und IMR-5 durchgeführt. Ergebnisse: Die Ringschlussverbindungen aller untersuchten circRNA Kandidaten konnten erfolgreich amplifiziert und durch Sanger Sequenzierung nachgewiesen werden. Alle Kandidaten bis auf circTet2 zeigten nach RNase-R Behandlung eine höhere Stabilität als ihre zugehörigen mRNAs. In den Expressionsanalysen zeigte sich kein eindeutig erkennbares Muster. Der Großteil der Kandidaten zeigte keine Korrelation zu den jeweils zugehörigen mRNAs. Der Knockdown von circARID1A zeigte sich als spezifisch ohne die Expression der ARID1A mRNA oder dem Protein zu beeinflussen und hatte in IMR-5 Zellen eine Abnahme der Zellzahlen, der Zellviabilität und der Proliferation zur Folge. Die Zellen zeigten vermehrt Apoptose. SH-SY5Y Zellen bildeten nach Knockdown vermehrt Ausläufer und Zell-Zell-Kontakte. Die Überexpression zeigte keinen messbaren Effekt auf SH-EP Zellen. Der Effekt des Knockdowns konnte durch das Rescue Experiment nicht rückgängig gemacht werden. Zusammenfassung 6 Diskussion: Die Sequenzierungsdaten konnten erfolgreich validiert werden. Expressionsanalysen suggerieren einen unabhängigen Mechanismus von der circRNA und mRNA Bildung. Wir identifizierten circARID1A als Neuroblastom-spezifische circRNA. Knockdown Experimente deuten auf tumorfördernde Eigenschaften von circARID1A im Neuroblastom hin. Zusammenfassend zeigt diese Studie die Relevanz von circRNAs im Neuroblastom am Beispiel von circARID1A. Dies kann bei der weiteren Entschlüsselung der Rolle von circRNAs im Neuroblastom und ihrer Etablierung als neue therapeutische Zielstrukturen und Biomarker helfen.Background: Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNA, which originate from alternative splicing, termed backsplicing and contribute to gene expression regulation. They are highly abundant in neural tissues and play a role in cancer biology. Neuroblastoma develops from progenitor cells of the neural crest and is the most common extracranial tumor in childhood. Unfortunately, about 50% of the children present with high-risk disease at time of diagnosis. Performing Total RNA sequencing 5171 circRNAs were identified in 104 primary neuroblastoma samples. Among them was circARID1A. CircARID1A was upregulated in neuroblastoma compared to other tumor entities and healthy brain tissue. This study aims to characterize circARID1As function in neuroblastoma. Methods: A selection of seven identified circRNAs was validated in a panel of neuroblastoma cell lines using qRT-PCR, Sanger Sequencing and RNase-R treatment. Northern Blot was used for further validation of circARIDA. Expression analysis for all seven circRNA candidates were performed in 11 neuroblastoma cell lines. We investigated cell numbers, cell viability, proliferation, apoptosis and differentiation after knockdown of circARID1A in the neuroblastoma cell lines SH-SY5Y and IMR-5. In the following an overexpression model using the cell line SHEP was created and a rescue experiment in SH-SY5Y und IMR-5 was performed. Results: The head-to-tail junctions of all seven circRNA candidates were amplified and sequenced successfully. All candidates except for circTet2 were significantly more resistant to RNase-R compared to their mRNAs. Within the cell lines we found for most of the circRNAs no correlation in their expression with their host gene´s expression. Knockdown of circARID1A in IMR-5 resulted in a reduction of cell numbers, cell viability and proliferation and led to differentiation in SH-SY5Y cells. Neither knockdown, nor overexpression of circARID1A influenced ARID1A mRNA levels or protein levels. Overexpression of circARID1A showed no measurable impact on SH-EP cells. The effect seen after knockdown, could not be reversed by the rescue experiment. Discussion: Data generated by sequencing were validated successfully. Expression analysis suggests an independent regulation of circRNA and mRNA biogenesis. We identified circARID1A as a neuroblasoma specific circRNA. Knockdown experiments indicated an oncogenic role of circARID1A in neuroblastoma, which seemed to be independent of ARID1A mRNA and protein expression. In summary, this study shows the importance of circRNAs in neuroblastoma using the Abstract 8 example of circARID1A. This may help to elucidate the role of non-coding RNAs in neuroblastoma biology and to establish circRNAs as new therapeutic targets and biomarkers

Defining the landscape of circular RNAs in neuroblastoma unveils a global suppressive function of MYCN

Circular RNAs (circRNAs) are a regulatory RNA class. While cancer-driving functions have been identified for single circRNAs, how they modulate gene expression in cancer is not well understood. We investigate circRNA expression in the pediatric malignancy, neuroblastoma, through deep whole-transcriptome sequencing in 104 primary neuroblastomas covering all risk groups. We demonstrate that MYCN amplification, which defines a subset of high-risk cases, causes globally suppressed circRNA biogenesis directly dependent on the DHX9 RNA helicase. We detect similar mechanisms in shaping circRNA expression in the pediatric cancer medulloblastoma implying a general MYCN effect. Comparisons to other cancers identify 25 circRNAs that are specifically upregulated in neuroblastoma, including circARID1A. Transcribed from the ARID1A tumor suppressor gene, circARID1A promotes cell growth and survival, mediated by direct interaction with the KHSRP RNA-binding protein. Our study highlights the importance of MYCN regulating circRNAs in cancer and identifies molecular mechanisms, which explain their contribution to neuroblastoma pathogenesis