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Caractérisation des domaines génomiques réparés dans les cellules humaines XP-C
Les dimĂšres de pyrimidines causĂ©s par les rayonnements ultra-violets sont rĂ©parĂ©s par un mĂ©canisme dâexcision. Les cellules en culture provenant de patients souffrant de Xeroderma Pigmentosum ont une dĂ©ficience dans la rĂ©paration de ces lĂ©sions, en particulier, les cellules XP du groupe C ne rĂ©parent que 15-20 % des dimĂšres produits. Pour vĂ©rifier si cette rĂ©paration se limite Ă certains domaines spĂ©cifiques du gĂ©nome, nous avons mesurĂ© la distribution des zones de rĂ©paration selon la complexitĂ© des sĂ©quences par la mĂ©thode de Cot, et vĂ©rifiĂ© si la transcription est nĂ©cessaire pour la rĂ©paration. Les zones rĂ©parĂ©es chez XP-C, sont distribuĂ©es dans tout le gĂ©nome mais de façon plus importante dans les sĂ©quences rĂ©pĂ©titives (rĂ©paration relative: sĂ©quences hautement rĂ©pĂ©titives, 1,133 ; sĂ©quences moyennement rĂ©pĂ©titives, 1,035; sĂ©quences copie unique, 0,938). Tandis que chez les cellules normales, la rĂ©paration est lĂ©gĂšrement plus Ă©levĂ©e dans les sĂ©quences uniques (rĂ©paration relative: 0,818 ; 0,879; 1,120). Pour vĂ©rifier lâinfluence de la transcription, nous avons mesurĂ© la synthĂšse de rĂ©paration par lâincorporation de nuclĂ©otides radioactifs et lâaccumulation des sites incisĂ©s par Ă©lution alcaline en prĂ©sence dâun inhibiteur de la transcription, lâα-amanitine. Nous avons ainsi observĂ© une inhibition de 80-100% de la rĂ©paration chez les cellules XP-C, 3 heures aprĂšs irradiation aux ultraviolets (20 J/m2). Par contre, chez les cellules normales lâeffet est presque nul. Ces rĂ©sultats suggĂšrent un rĂŽle de la transcription dans la rĂ©paration par excision
Purification de fragments dâADN humain contenant une zone de rĂ©paration par excision
Dans le but dâĂ©tudier la rĂ©paration de lâADN dans des sĂ©quences spĂ©cifiques du gĂ©nome humain, nous avons dĂ©veloppĂ© une mĂ©thode pour purifier des fragments dâADN contenant une zone de rĂ©paration par excision. Le principe consiste Ă incorporer dans les zones rĂ©parĂ©es, le dĂ©soxyuridine monophosphate marquĂ© Ă la biotine, une molĂ©cule pour laquelle la streptavidine a une haute affinitĂ©. Le complexe biotine-streptavidine confĂšre aux fragments dâADN marquĂ©s de nouvelles propriĂ©tĂ©s permettant leur purification. Plus prĂ©cisĂ©ment, nous avons utilisĂ© des fibroblastes humains normaux endommagĂ©s avec les rayons UV, que nous avons permĂ©abilisĂ©s puis incubĂ©s en prĂ©sence dâATP, dATP, dGTP, [3H]dCTP et biodUTP pour permettre la synthĂšse rĂ©paratrice. LâADN a ensuite Ă©tĂ© purifiĂ©, fragmentĂ© par sonication en fragments dâenviron 150 pb puis incubĂ© avec la streptavidine (Kd du complexe biotine libre-streptavidine 10-15) ayant une densitĂ© de 1,33 g/ml dans le CsTFA comparĂ© Ă 1,6 g/ml pour lâADN non-marquĂ©. La centrifugation isopycnique rĂ©sulte en la sĂ©paration des fragments dâADN rĂ©parĂ©s et marquĂ©s Ă la biotine de ceux non-rĂ©parĂ©s. Cette mĂ©thode est applicable pour tous types de dommages Ă lâADN rĂ©parĂ©s par la voie dâexcision-resynthĂšse incluant les dommages causĂ©s par les carcinogĂšnes chimiques et les radiations ionisantes