Dans le but d’étudier la réparation de l’ADN dans des séquences spécifiques du génome humain, nous avons développé une méthode pour purifier des fragments d’ADN contenant une zone de réparation par excision. Le principe consiste à incorporer dans les zones réparées, le désoxyuridine monophosphate marqué à la biotine, une molécule pour laquelle la streptavidine a une haute affinité. Le complexe biotine-streptavidine confère aux fragments d’ADN marqués de nouvelles propriétés permettant leur purification. Plus précisément, nous avons utilisé des fibroblastes humains normaux endommagés avec les rayons UV, que nous avons perméabilisés puis incubés en présence d’ATP, dATP, dGTP, [3H]dCTP et biodUTP pour permettre la synthèse réparatrice. L’ADN a ensuite été purifié, fragmenté par sonication en fragments d’environ 150 pb puis incubé avec la streptavidine (Kd du complexe biotine libre-streptavidine 10-15) ayant une densité de 1,33 g/ml dans le CsTFA comparé à 1,6 g/ml pour l’ADN non-marqué. La centrifugation isopycnique résulte en la séparation des fragments d’ADN réparés et marqués à la biotine de ceux non-réparés. Cette méthode est applicable pour tous types de dommages à l’ADN réparés par la voie d’excision-resynthèse incluant les dommages causés par les carcinogènes chimiques et les radiations ionisantes
