Classification non supervisée par HMM de sites de fixation de facteurs de transcription chez les bactéries

Colloque avec actes et comité de lecture. nationale.National audienceNous développons des méthodes de fouille de données basées sur l'utilisation de modèles Markoviens du second ordre adaptés à l'étude des génomes. Ceux-ci réalisent une segmentation pouvant être observée sous la forme d'un signal stochastique traduisant l'organisation et la structure des motifs d'ADN sous-jacents. Aucune hypothèse 'a priori' n'est effectuée sur le contenu génétique des séquences étudiées. La modélisation du corpus de séquences est réalisée par une étape d'apprentissage automatique qui produit une classification non supervisée des segments nucléotidiques observés sur les différents états des HMM. Une première étape d'apprentissage sur les séquences chromosomiques complètes des bactéries actinomycètes Streptomyces coelicolor, S. avermitilis et Mycobacterium tuberculosis permet l'obtention de trois classes de HMM décrivant chacune un génome. Lors du processus de segmentation, certaines chaînes d'états cachés décrivent des fragments génomiques comme les gènes et les séquences intergéniques alors qu'une autre chaîne se spécialise sur la distribution de motifs d'ADN locaux particuliers. Ceux-ci correspondent à des mots de 5 à 12 nucléotides présents à des fréquences inhabituelles dans les régions intergéniques. Chez S. coelicolor, la classification de 2500 de ces motifs, issus d'une extraction automatique et identifiés dans 1,2 Mb d'ADN génomique, indique que 7% correspondraient à des sites de fixation de facteurs sigma connus (SigR, SigB, WhiG, HrdB) et 5% à des sites de fixation du ribosome ou des terminateurs de transcription potentiels. Concernant le régulon SigR/SigH (réponse au stress oxydant chez les Streptomyces/M. tuberculosis), la mise en oeuvre de cette approche a permis de détecter tous les promoteurs déjà déterminés biologiquement. Enfin, certains de ces motifs ne peuvent être corrélés à des rôles biologiques connus ou prédits à ce jour. Leur classification pourrait mettre en évidence des groupes à propriétés communes et viserait à définir des motifs promoteurs, puis, à terme, des réseaux de gènes co-régulés

Differentiation-Dependent Secretion of Proangiogenic Factors by Mesenchymal Stem Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising cell population for cell-based bone repair due to their proliferative potential, ability to differentiate into bone-forming osteoblasts, and their secretion of potent trophic factors that stimulate angiogenesis and neovascularization. To promote bone healing, autogenous or allogeneic MSCs are transplanted into bone defects after differentiation to varying degrees down the osteogenic lineage. However, the contribution of the stage of osteogenic differentiation upon angiogenic factor secretion is unclear. We hypothesized that the proangiogenic potential of MSCs was dependent upon their stage of osteogenic differentiation. After 7 days of culture, we observed the greatest osteogenic differentiation of MSCs when cells were cultured with dexamethasone (OM+). Conversely, VEGF protein secretion and upregulation of angiogenic genes were greatest in MSCs cultured in growth media (GM). Using conditioned media from MSCs in each culture condition, GM-conditioned media maximized proliferation and enhanced chemotactic migration and tubule formation of endothelial colony forming cells (ECFCs). The addition of a neutralizing VEGF165/121 antibody to conditioned media attenuated ECFC proliferation and chemotactic migration. ECFCs seeded on microcarrier beads and co-cultured with MSCs previously cultured in GM in a fibrin gel exhibited superior sprouting compared to MSCs previously cultured in OM+. These results confirm that MSCs induced farther down the osteogenic lineage possess reduced proangiogenic potential, thereby providing important findings for consideration when using MSCs for bone repair

Gènes de la réponse au stress oxydant de Streptococcus thermophilus (implication de la famille multigénique polymorphe codant des régulateurs transcriptionnels Rgg-like)

La réponse au stress oxydant de la bactérie Streptococcus thermophilus a été caractérisée par analyse au niveau génétique et physiologique de mutants, présentant une modification de leur comportement vis-à-vis d'un agent oxydant générateur d'ions O2ʹ. Deux mutants, présentant une sensibilité accrue au stress oxydant et une modification de leur morphologie cellulaire, sont interrompus dans des gènes intervenant dans la synthèse du peptidoglycane. L'analyse de 2 mutants présentant une résistance accrue a ce stress a permis d'impliquer le pool de guanine et de glutamate dans la réponse au stress oxydant. Cinq autres mutants résistants, montrent une interruption dans des gènes de fonction indéterminée. La famille de gènes rgg-like, codant potentiellement des régulateurs transcriptionnels, a été impliquée dans la réponse au stress oxydant. Le locus rggC présente un décalage de phase de lecture et pourrait être sujet à la variation de phase et/ou mécanisme de "frameshift" programmé.The oxidative stress response of the bacterium Streptococcus thermophilus was characterised by genetic and physiologic analysis of mutants altered in their tolerance to a superoxide-generating compound. Two oxidative stress-sensitive mutants have altered cellular morphologies and were disrupted in genes involved in peptidoglycan biosynthesis. Analysis of 2 oxidative stress-resistant mutants allows involvement of guanine nucleotide pool and glutamate concentration in oxidative stress response. Other five oxidative stress-resistant mutants were disrupted in gene of unknown function and an oxidative stress-resistant phenotype can be linked to the disruption of these genes. Family of rgg genes, encoding putative transcriptional regulators, was involved in oxidative stress response of S. thermophilus. The rggC locus displays a frameshifting mutation. This gene could undergo phase variation and/or a frameshifting programmed mechanism.NANCY1-SCD Sciences & Techniques (545782101) / SudocSudocFranceF

Etude structurale et fonctionnelle du cluster eps de Streptococcus thermophilus IP6756 (spécificités et hypothèses nouvelles)

L'organisation du cluster eps de S. thermophilus IP6756 est très particulière. Ainsi, chez cette souche productrice d'EPS, le module de régulation n'est constitué que de deux des quatre ORF présentes dans les autres clusters eps de l'espèce. De même, le module de biosynthèse et d'export n'est constitué que de deux ORF. Enfin, les produits potentiels de ces ORF ne présentent aucune homologie avec des glycosyltransférases. Sur le plan fonctionnel, le cluster eps de cette souche présente une organisation opéronique. Son interruption s'accompagne du maintien de la production d'EPS. Un ou plusieurs gènes extérieurs au cluster eps seraient donc nécessaires à la biosynthèse des EPS de la souche IP6756, notamment ceux codant les glycosyltransférases nécessaires. Comme les autres clusters eps de S. thermophilus, le cluster eps de la souche IP6756 contient orf14.9 dont la fonction est inconnue et qui est transcrite. Les expériences d'interruption réalisées n'ont pas permis d'établir un lien entre la fonctionnalité de cette ORF et la production d'EPS, au moins sur un plan quantitatif. Par contre, il semble que l'intégrité de cette ORF soit nécessaire à une croissance optimale de S. thermophilus.The S. thermophilus IP6756 eps cluster organization is very original. On the one hand in that EPS-producing strain only two ORF compose the regulation module instead of four for other eps cluster of this specie and on the other hand, only two ORF form the biosynthesis-export module. Interestingly, none of those ORF products display glycosyltransferase enzyme homology. Functional study of this cluster shows that it is organized in operon and that its polar interruption does not lead to any modification in EPS yield. All these results indicate that the S. thermophilus IP6756 eps cluster is not involved in EPS production (on quantitative terms) and that EPS production is under control of gene(s) elsewhere in the genome, particularly glycosyltransferases genes. Like other S. thermophilus eps clusters, the genome of the IP6756 strain displays orf14.9, whose function is unknown. This ORF is transcribed. After disruption experiments, no links can be established between this ORF function and EPS production, at least on quantitative term. Nevertheless, orf14.9 integrity seems to be necessary to an optimal growth of S. thermophilus.NANCY1-SCD Sciences & Techniques (545782101) / SudocSudocFranceF

Transfert, accrétion et mobilisation des éléments intégratifs conjugatifs et des îlots génomiques apparentés de "Streptococcus termophilus" (Un mécanisme clef de l'évolution bactérienne ?)

Des analyses de génomes avaient suggéré que de nombreux îlots génomiques bactériens seraient des éléments intégratifs conjugatifs (ICE) ou des éléments en dérivant. Les ICE s'excisent sous forme circulaire par la recombinaison site-spécifique, se transfèrent par conjugaison et s'intègrent chez une cellule réceptrice. Les éléments de ce type sont très abondants aux seins des génomes de bactéries et d'archées. Divers îlots génomiques apparentés sont intégrés dans l'extrémité 3' de l'ORF fda chez plusieurs souches de Streptococcus thermophilus. Cette famille inclut 2 éléments intégratifs potentiellement conjugatifs, dont ICESt3, et 4 éléments qui dérivent d'ICE par délétion, les CIME (cis mobilizable elements). Ce travail a montré qu'ICESt3 se transfère entre souches de S. thermophilus et entre espèces proches. Cet élément est le premier élément conjugatif identifié chez ce streptocoque. Le transfert d'ICESt3 vers une cellule portant un ICE ou un CIME intégré a conduit à l'accrétion site-spécifique d'ICESt3 et d'un îlot génomique apparenté. À partir de cellules portant un tandem CIME-ICE, le co-transfert du CIME et de l'ICE ainsi que le transfert du CIME seul ont été obtenus, démontrant la mobilisation conjugative d'un CIME par ICESt3. Ainsi, les îlots génomiques de S. thermophilus évoluent par accrétion site-spécifique et mobilisation conjugative. Par ailleurs, une analyse de séquences disponibles dans les bases de données et une analyse bibliographique suggèrent très fortement que les CIME sont très répandus et que les événements d'accrétion site-spécifique entre îlots génomiques jouent un rôle important dans l'évolution bactérienne.Analyses of genomes had suggested that numerous bacterial genomic islands would be integrative conjugative elements (ICEs) or elements deriving from them. ICEs excise under a circular form by site-specific recombination, transfer by conjugation, and integrate in a recipient cell. The type of elements is very widespread in genomes of bacteria and archaea. Various related genomic islands are integrated at the 3' of the fda ORF in different Streptococcus thermophilus strains. This family includes 2 integrative and potentially conjugative elements, of which ICESt3, and 4 elements deriving from ICEs by deletion and named CIMEs (cis mobilizable elements). This work has demonstrated that ICESt3 transfers between S. thermophilus and related species. This element is the first conjugative element identified in this streptococcus. The ICESt3 transfer to a cell already carrying an ICE or a CIME leads to the characterization of site-specific accretions of ICESt3 and a related genomic island. Using donor cell harboring a CIME-ICE tandem, the co-transfer of the CIME and the ICE, the transfer of the ICE and the transfer of the only CIME were obtained, demonstrating conjugative mobilization of a CIME by ICESt3. Thus, the genomic islands from S. thermophilus evolve by site-specific accretion and conjugative mobilization. Moreover, an analysis of sequences from databases and an analysis of literature strongly suggest that CIMEs are widespread and that site-specific accretions between genomic islands play a key role in bacterial evolution.NANCY1-Bib. numérique (543959902) / SudocSudocFranceF

Le gène cse, de création récente, code une hydrolase du peptidoglycane impliquée dans la séparation des cellules de Streptococcus thermophilus

Streptococcus thermophilus est une bactérie lactique utilisée dans l industrie laitière pour la fabrication de yaourts et de divers fromages. S. thermophilus se développe en chaîne de cellules. Le mécanisme de la séparation des cellules n est pas connu chez S. thermophilus. Un mutant de S. thermophilus présentant des chaînes de cellules extrêmement longues a été caractérisé. Le gène identifié est nommé cse pour cell separation. La particularité de cse est qu il résulte d un réassortiment de modules. En effet, l analyse a montré que son extrémité 5 est homologue à celle de sip de S. salivarius, tandis que son extrémité 3 est homologue à celle de pcsB de S. thermophilus. Le gène cse spécifique de S. thermophilus code une protéine modulaire. A son extrémité N-terminale, Cse possède un peptide signal et un domaine de liaison à la paroi, LysM. Et à son extrémité C-terminale, Cse possède un domaine CHAP, présent dans les hydrolases du peptidoglycane. Dans cette étude, la localisation de Cse à la surface des cellules de S. thermophilus a été réalisée par microscopie électronique à transmission et immunofluorescence à l aide d anticorps dirigés contre cette protéine. Cse est localisée spécifiquement aux septa matures de S. thermophilus. De plus, l activité de Cse a été démontré par zymogramme et présente une activité lytique qui est conférée par son domaine CHAP. L analyse par RP-HPLC des muropeptides de la paroi de S. thermophilus après digestion avec le domaine CHAP a révélé que Cse est une hydrolase du peptidoglycane et plus précisément une endopeptidase. L ensemble de ces résultats montre que Cse est l enzyme majeure de la séparation cellulaire de S. thermophilus.Streptococcus thermophilus is a lactic bacteria used a stater of fermentation in dairy factories for the production of yogurt and many cheeses. S. thermophilus grows as chains of ovoid cells. However, the genetic basis of S. thermophilus cell separation is still unknown. A S. thermophilus mutant displaying extremely long chains of cells was characterized and demonstrated to be impaired a gene that we named cse for cell separation. The originality of this gene is that cse creation resulted from domain shuffling. Indeed, the analysis has revealed that its 5 extremity has homology with that of sip from S. salivarius, while its 3 extremity shares homology with pcsB from S. thermophilus.The cse gene specific from S. thermophilus, encodes a modular protein. The N-terminal end of Cse contains a secretion signal and cell-wall binding LysM domain. Its C-terminal end includes a CHAP domain found in bacterial cell-wall hydrolases. In this study, the localization of Cse on S. thermophilus cell surface has been undertaken by immunogold electron and immunofluorescence microscopies using of antibodies raised against this protein. Immunolocalization shows that the presence of the Cse protein at mature septa. Moreover, the CHAP domain of Cse exhibits a lytic activity on the cell wall of S. thermophilus that has been demonstrated by zymogram. Additionally, RP-HPLC analysis of muropeptides released from S. thermophilus after digestion with the CHAP domain shows that Cse is a cell wall hydrolase that can function as an endopeptidase. Alltogether, these results suggest that Cse is a major cell wall hydrolase involved in daughter cell separation of S. thermophilus.NANCY1-Bib. numérique (543959902) / SudocSudocFranceF

La génération d'un polymorphisme génétique intraclonal est modulée pendant la différenciation chez Streptomyces ambofaciens ATCC23877

NANCY1-SCD Sciences & Techniques (545782101) / SudocSudocFranceF

Défense de Streptococcus thermophilus contre le stress oxydatif (existence d'un système de réponse, construction et sélection d'une collection de mutants, identification de gènes impliqués)

Streptococcus thermophilus est un organisme anaérobie aérotolérant. Un système de défense inductible contre le peroxyde d'hydrogène a pu être mis en évidence, et participe à l'aérotolérance de la souche CNRZ368. Afin d'identifier des gènes impliqués dans la défense contre le stress oxydatif, des mutants obtenus par mutagenèse insertionnelle ont été sélectionnés pour leur sensibilité ou résistance à un tel stress. L'analyse moléculaire des mutants ainsi sélectionnés révèle que les loci interrompus peuvent être classés en 4 catégories : ceux portant des gènes présentant un lien potentiel avec la défense contre le stress oxydatif, ceux potentiellement impliqués dans la synthèse de la paroi, ceux potentiellement impliqués dans le métabolisme général, ceux portant des gènes de fonction inconnue. Deux mutants, interrompus dans des gènes homologues de rodA et pbp2b sont affectés dans leur forme cellulaire, confirmant que les gènes affectés chez ces deux mutants seraient les homologues fonctionnels des gènes rodA et pbp2b, impliqués dans l'élongation de la paroi latérale. Deux autres mutants sont affectés dans deux ORF distinctes mais localisées au même locus. Cette région contient au moins 4 ORF dont les produits hypothétiques sont homologues de protéines impliquées dans la maturation des centres Fe-S. Une analyse transcriptionnelle permet de montrer leur cotranscription. Une mutagenèse dirigée sur l'une des 4 ORF (nifU-like) permet d'impliquer celle-ci directement dans la défense contre le stress oxydatif. Parallèlement, une étude du phénotype colonial de la souche CNRZ368 a permis d'identifier l'existence de variants spontanés apparaissant à une fréquence proche du pourcent. La détection de ces phénotypes est conditionnelle à la présence d'oxygène. De plus, ces clones variants sont fréquemment résistants à un stress oxydatif, suggérant l'existence d'un lien (bien que non strict) entre ces variants et le niveau de résistance contre le stress oxydatif.Streptococcus thermophilus is an anaerobic aerotolerant organism. A hydrogen peroxide defence system had been shown to be inducible in the CNRZ368 strain, and may take part in its aerotolerance . In order to identify genes involved in S. thermophilus defence against oxidative stress, clones from a mutant collection obtained by insertional mutagenesis, had been selected for their sensitivity or resistance to an oxidative stress. Molecular analysis of mutants selected under these conditions showed that their disruption sites can be classified in 4 categories: those that carried genes potentially linked to oxidative stress defence, those potentially involved in cell wall biosynthesis, those potentially involved in general metabolism, those that carried genes of unknown function. Two mutants, disrupted in genes homologous to rodA et pbp2b were affected in their cell shape, confirming that these genes were probably functional homologues of rodA and pbp2b genes involved in elongation of lateral cell wall. Two other mutants were affected into two distinct ORF but localised in the same locus. This region contained at least 4 ORF whose hypothetical translation products are homologous to proteins involved in Fe-S centers maturation. A transcriptional analysis showed their cotranscription. Directed mutagenesis affecting one of the 4 ORF (nifU-like) allowed to demonstrate its direct involvement in oxidative stress defence.Moreover, study of CNRZ368 colonial phenotype revealed the existence of spontaneous variants that appeared with a frequency of almost one percent. Detection of variant phenotypes was conditional to oxygen presence during growth. In addition, variant clones often displayed a better resistance to oxidative stress than did the wild-type strain, suggesting a link (although it is not a strict link) between these variants and the resistance against oxidative stress level.NANCY1-SCD Sciences & Techniques (545782101) / SudocSudocFranceF

Création de gènes par réassortiment de modules (caractères chimérique et variable de cse, un gène impliqué dans la ségrégation cellulaire chez la bactérie Streptococcus thermophilus)

Nous avons identifié chez Streptococcusthermophilus un gène, nommé cse (Cell Segregation), qui est impliquée dans la ségrégation cellulaire. Ce gène qui code une protéine extracellulaire, présente un caractère chimérique suggèrant qu'il a été générée par réassortiment de fragments de gènes ou modules. Il semblerait que le site de fusion des fragments de gènes à l'origine de cse soit localisé à l'intérieur de la région centrale du gène cse dont la séquence est de faible complexité, riche en répétitions, et variable au niveau intraspécifique. Il a été montré que cette région peut subir d'importantes modifications de sa séquence sans que l'activité de ségrégation cellulaire de la protéine en soit affectée. Nous proposons que la présence, dans les gènes, de régions variables et de faible complexité favorise la génération de nouvelles protéines actives par réassortiment de domaines.A gene named cse and involved in cell segregation was identified in Streptococcus thermophilus. This gene encodes an extracellular protein which chimerical nature suggests it has been created by domain shuffling. Sequence analysis suggest that the fusion site of the gene fragments originating cse is localized inside a region of the gene which sequence is of low complexity, repeat rich and variable. It was demonstrated that this region can undergoes lot of changes without any consequences on cell segregation activity of the Cse protein. This allowed us to propose that the existence of intragenic sequences displaying variability and low complexity can favor new protein creation by domain shuffling.NANCY1-SCD Sciences & Techniques (545782101) / SudocSudocFranceF

Action de facteurs génétiques et environnementaux sur la dynamique mutationnelle au cours de la différenciation chez Streptomyces ambofaciens ATCC23877

Des mutants issus de l'instabilité génétique chez Streptomyces ambofaciens appelés Pig-pap ont été caractérisés. L'analyse du chromosome de la souche 29C1 a révélé un nouveau type de réarrangement associé à la production d'un pigment vert. Les mutants Pig-pap dépigmentés et non sporulants sont issus de papilles sur les colonies. L'introduction du gène whiG codant un facteur sigma permet le retour à la sporulation et à la pigmentation. Ce gène n'est pas muté et est transcrit chez ces mutants. Le gène whiH dont la transcription dépend de WhiG n'est pas transcrit. WhiG ne serait pas fonctionnel et une modification post-transcriptionnelle de whiG aboutirait au phénotype Pig-pap. L'analyse de mutants issus d'un transconjugant a montré que le transgène whiG constitue une cible mutationnelle. De plus, la production de ces mutants est augmentée lors d'une carence en acides aminés et un mutant relA ne produit pas de papille, impliquant la réponse stringente dans ce phénomène.In Streptomyces ambofaciens, mutants generated by genetic instability and named Pig-pap were characterised. Analyses of the chromosome of the 29C1 strain revealed a new type of rearrangement associated to the production of a green pigment. The Pig-pap mutants, pigment and spore deficient, derived from papillae on the colonies. The introduction of the whiG gene coding a sigma factor restored sporulation and pigmentation. In these mutants, this gene is not mutated and is transcribed. whiH gene whose transcription depends on WhiG is not transcribed. WhiG would be not fonctional and a post-transcriptional modification could be responsible of the Pig-pap phenotype. Study of mutants derived from a transconjugant showed that the whiG transgene constitute a target of mutations. More, the production of mutants is increased during a amino acids limitation and a relA mutant does not produce papilla, implicating the stringent response in this phenomenon.NANCY1-SCD Sciences & Techniques (545782101) / SudocSudocFranceF