Etude des effets de l'hypoxie cyclique et du TNFalpha sur les cellules endothéliales : Activation du facteur NF-kappaB et d'un phénotype pro-inflammatoire et pro-angiogénique

Cycling hypoxia, which is periods of hypoxia followed by reoxygenation, is a hallmark of solid tumors that originate from the instability of the tumor blood flow. Cycling hypoxia may influence cancer cell as well as endothelial cell physiology and is described to favour survival and pro-angiogenic phenotype in endothelial cells. However, the molecular mechanisms underlying these effects remain largely unknown. The hypoxia-reoxygenation cycles are thought to induce oxidative stress in the tumor vasculature that could activate an anti-oxidant response in endothelial cells. Solid tumors are also characterized by a pro-inflammatory environment generated by cancer and immune cells, the major pro-inflammatory mediator being TNFα. In this work, we investigated the specific effects of cycling hypoxia, compared to continuous hypoxia and normoxia, on the activation of Nrf2 and NF-κB pathways in EA.hy926 endothelial cells and HUVEC by tBHQ and SIN-1, or TNFα respectively. We showed that cycling hypoxia inhibited Nrf2 response to tBHQ or SIN-1 by up-regulating the Nrf2 inhibitor Bach1. On the other hand, cycling hypoxia increased the activation of NF-κB initiated by TNFα in endothelial cells, probably by slowing down the negative feedback loop engaged by newly synthesized IκBα. The pro-inflammatory response initiated by TNFα was further enhanced by cycling hypoxia as both IL-8 and ICAM-1 were overexpressed at gene and protein levels. Furthermore, cycling hypoxia fostered elevated IL-6 secretion independently of gene regulation. Silencing of p65 and of HIF-1α expression with targeting siRNA highlighted the implication of NF-κB, but not of HIF-1, in the up-regulated secretion of IL-6 and the accumulation of ICAM-1. Finally, we showed that cycling hypoxia induced a strong increase in the migratory ability of EA.hy926 endothelial cells, suggesting an effect toward a pro-angiogenic phenotype. Endothelial cells exposed to cycling hypoxia and stimulated with TNFα thus seem to participate to the development of a pro-inflammatory environment potentially beneficial for tumor growth and metastasisL'hypoxie cyclique, définie comme une succession de périodes d'hypoxie et de réoxygénation, est un phénomène couramment observé dans les tumeurs solides et lié à l'instabilité du flux sanguin tumoral. L'hypoxie cyclique conditionne les cellules tumorales, mais aussi les cellules endothéliales, pour les rendre plus résistantes à l'apoptose et plus susceptibles de participer à la progression de la tumeur, notamment en favorisant un phénotype angiogénique. Cependant, les mécanismes moléculaires responsables de ces effets restent largement inconnus. Il est généralement admis que les cycles d'hypoxie-réoxygénation induisent des dommages oxydatifs dans les vaisseaux tumoraux susceptibles de déclencher une réponse anti-oxydante et pro-inflammatoire dans les cellules endothéliales. Le microenvironnement tumoral est également caractérisé par une réponse inflammatoire engendrée par les cytokines inflammatoires produites par les cellules tumorales et immunitaires, le TNFα jouant un rôle majeur en tant que médiateur inflammatoire. Dans ce travail, nous avons étudié les effets spécifiques de l'hypoxie cyclique, en comparaison à l'hypoxie continue et à la normoxie, sur l'activation des voies Nrf2 et NF-κB par le tBHQ et le SIN-1, ou le TNFα respectivement, dans les cellules endothéliales EA.hy926 et HUVEC. Nous avons ainsi montré que l'hypoxie cyclique diminue l'activation de Nrf2 induite par le tBHQ ou le SIN-1 en augmentant l'abondance nucléaire de Bach1, un inhibiteur de Nrf2. Par ailleurs, l'hypoxie cyclique augmente l'activation de NF-κB induite par le TNFα dans les cellules endothéliales, probablement en différant la boucle de rétroaction négative enclenchée par la synthèse d'IκBα. La réponse inflammatoire initiée par le TNFα est également amplifiée par l'hypoxie cyclique puisque l'IL-8 et ICAM-1 sont surexprimés à la fois au niveau génique et au niveau protéique. De plus, l'hypoxie cyclique induit une augmentation de la sécrétion d'IL-6 induite par le TNFα de façon indépendante de l'expression génique. L'inhibition de l'expression de p65 et de HIF-1α par siRNA a permis de montrer l'implication de NF-κB, mais pas de HIF-1, dans l'augmentation de la sécrétion d'IL-6 et dans l'accumulation d'ICAM-1. Enfin, nous avons montré que l'hypoxie cyclique induit une nette augmentation de la capacité de migration des cellules endothéliales EA.hy926, suggérant une implication de l'hypoxie cyclique dans l'établissement d'un phénotype pro-angiogénique. Les cellules endothéliales exposées à l'hypoxie cyclique et stimulées avec du TNFα semblent donc participer à la mise en place d'un environnement pro-inflammatoire potentiellement favorable à la croissance tumorale et à la formation de métastases.  (DOCSC03) -- FUNDP, 201

Cycling hypoxia induces a specific amplified inflammatory phenotype in endothelial cells and enhances tumor-promoting inflammation in vivo.

Abnormal architecture of the tumor blood network, as well as heterogeneous erythrocyte flow, leads to temporal fluctuations in tissue oxygen tension exposing tumor and stromal cells to cycling hypoxia. Inflammation is another feature of tumor microenvironment and is considered as a new enabling characteristic of tumor progression. As cycling hypoxia is known to participate in tumor aggressiveness, the purpose of this study was to evaluate its role in tumor-promoting inflammation. Firstly, we assessed the impact of cycling hypoxia in vitro on endothelial inflammatory response induced by tumor necrosis factor α. Results showed that endothelial cells exposed to cycling hypoxia displayed an amplified proinflammatory phenotype, characterized by an increased expression of inflammatory cytokines, namely, interleukin (IL)-6 and IL-8; by an increased expression of adhesion molecules, in particular intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1); and consequently by an increase in THP-1 monocyte adhesion. This exacerbation of endothelial inflammatory phenotype occurs through nuclear factor-κB overactivation. Secondly, the role of cycling hypoxia was studied on overall tumor inflammation in vivo in tumor-bearing mice. Results showed that cycling hypoxia led to an enhanced inflammation in tumors as prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), IL-6, CXCL1 (C-X-C motif ligand 1), and macrophage inflammatory protein 2 (murine IL-8 functional homologs) mRNA expression was increased and as a higher leukocyte infiltration was evidenced. Furthermore, cycling hypoxia-specific inflammatory phenotype, characterized by a simultaneous (baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5)(low)/PTGS2(high)/ICAM-1(high)/IL-6(high)/IL-8(high) expression, is associated with a poor prognosis in human colon cancer. This new phenotype could thus be used in clinic to more precisely define prognosis for colon cancer patients. In conclusion, our findings evidenced for the first time the involvement of cycling hypoxia in tumor-promoting inflammation amplification