Study on the influence of PemKSa toxin from the toxin-antitoxin system PemIKSa on intracellular proteom of Staphylococcus aureus

Gronkowiec złocisty (łac. Staphylococcus aureus) jest powszechnie występującą, Gram-dodatnią bakterią, będącą niebezpiecznym patogenem oportunistycznym. Jest czynnikiem etiologicznym wielu chorób. Gronkowcowe systemy toksyna – antytoksyna (systemy TA), podobnie jak u innych bakterii są złożone z dwóch elementów – stabilnej toksyny, która zawsze jest białkiem i labilnej antytoksyny. Systemy TA zostały pierwotnie odkryte w plazmidach, gdzie pełniły rolę w ich utrzymaniu w danej populacji bakterii. System PemIKSa należy do systemów TA typu II, w którym zarówno toksyna, jak i antytoksyna są elementami białkowymi, a niestabilna antytoksyna oddziałuje z toksyną bezpośrednio. Toksyna w tym układzie jest sekwencyjnie specyficzną rybonukleazą. Podejrzewa się, że system PemIKSa może odgrywać pewną rolę regulatorową. Celem pracy było dokonanie analizy porównawczej dwóch mutantów gronkowca złocistego, jednego z indukowalną toksyną, a drugiego bez genu toksyny PemKSa. W realizacji założonego celu wykorzystano szereg metod wykorzystywanych w proteomice, czyli gałęzi nauki zajmującej się badaniem garniturów białkowych danego organizmu w określonych warunkach i czasie, takich jak na przykład różnicowa elektroforeza dwuwymiarowa DIGE. W wyniku przeprowadzonych badań wykryto, że proteomy badanych mutantów różnią się, oraz dodatkowo zauważono, że indukcja ekspresji toksyny powoduje zahamowanie wzrostu danego mutanta gronkowca złocistego.Staphylococcus aureus is a ubiquitous Gram-positive bacteria and a dangerous opportunistic pathogen. It is an etiological factor of many serious diseases. Staphylococcal toxin – antitoxin systems (TA systems), likewise in other bacteria, are composed of two elements – stable toxin, which is always a protein, and labile antitoxin. TA systems were originally discovered in plasmids, where they play a role in plasmid maintenance in a given bacteria population. The PemIKSa system belongs to Type II TA systems in whitch both toxin and antitoxin are proteins. Unstable antitoxin interacts with the toxin in direct way. The toxin in this particular system is a sequence-specific ribonuclease. It is suspected that the PemIKSa system may play a regulatory role. The aim of this study was to perform comparative analysis of two Staphylococcus aureus mutants, one with inducible toxin and the other without PemKSa toxin gene. Many proteomics methods were used to achive the goal eg. 2D-DIGE – two-dimensional differential gel electrophoresis. Proteomics is a science investigating protein fingerprints of given organisms in specific time and conditions. As a result of the research, it was found that the proteomes of the mutants tested differed, and additionally it was observed that the induction of the toxin expression had an effect on growth inhibition of a particular mutant of the Staphylococcus aureus

Analiza oddziaływania pomiędzy czynnikiem oporności na chinolony QnrB1 a gyrazą DNA metodą mapowania molekularnego in vivo

Wzrastająca wśród bakterii oporność na antybiotyki staje się znaczącym wyzwaniem dla medycyny. Poznanie mechanizmów powstawania oporności zajmuje zatem ważne miejsce w nauce. Przenoszone na plazmidach białko QnrB1 bierze udział w wytworzeniu oporności na fluorochinolony, chemioterapeutyki o działaniu bakteriobójczym zależnym od inhibicji gyrazy DNA. QnrB1 należy do rodziny białek PRP (ang. pentapeptide repeat protein). Gyraza DNA jest enzymem należącym do klasy topoizomeraz typu II, z których jako jedyna jest w stanie wprowadzać ujemne superskręcenie do DNA. Białka GyrA oraz GyrB w dwóch kopiach każde, składają się na heterotetrameryczny holoenzym. Fluorochinolony działają na gyrazę jak „trucizna” (ang. gyrase poison), zamieniając ją w endogenną toksynę, co powoduje akumulację dwuniciowych pęknięć nici DNA, powstających podczas funkcjonowania gyrazy, co z kolei prowadzi do zatrzymania replikacji i śmierci komórki. Mechanizm działania białka QnrB1 na gyrazę, prowadzący do wytworzenia oporności na fluorochinolony jest obecnie nieznany. W niniejszej pracy przedstawiono analizę oddziaływania pomiędzy gyrazą DNA, a białkiem oporności na chinolony, QnrB1 w bakteriach E. coli in vivo. Dzięki zastosowaniu systemu pEVOL, który oparty jest na wyewoluowanych z Methanocaldococcus jannaschii parach – syntetaza aminoacylo-tRNA/supresorowe tRNA, możliwe było wprowadzenie fotosieciującego aminokwasu – p-benzoilo-L-fenyloalaniny (pBpa) do białka QnrB1 in vivo. Komórki z naturalnym poziomem ekspresji gyrazy (bez nadekspresji) i zmutowanym QnrB1 były naświetlane światłem ultrafioletowym. Ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe prowadzi do specyficznego sieciowania, a połączone w ten sposób białka mogą następnie być identyfikowane z użyciem techniki Western blot poprzez detekcję odpowiednich znaczników powinowactwa obecnych na badanych białkach. W białku QnrB1 zidentyfikowano kilka pozycji, które po podstawieniu na pBpa tworzą wiązanie poprzeczne (ang. crosslink) z podjednostkami gyrazy, które z kolei są widoczne jako przesunięcia prążków w kierunku wyższych mas cząsteczkowych po wywołaniu membrany. Praca ta stanowi pierwszy krok w kierunku znalezienia potencjalnego miejsca wiązania białka QnrB1 do gyrazy DNA oraz zrozumienia jego mechanizmu działania.Growing antibiotic resistance among bacteria is becoming a significant challenge in medicine. Understanding the mechanisms whereby resistance is achieved is therefore of great interest. One mechanism of plasmid-borne resistance to fluoroquinolone antibacterials relies on QnrB1, a member of the pentapeptide repeat protein (PRP) family and targets DNA gyrase. DNA gyrase is a type II topoisomerase, with the unique capability of introducing negative supercoils into DNA. It is a heterotetramer consisting of two copies each of GyrA and GyrB proteins. Fluoroquinolones act as gyrase poisons, converting gyrase into an endogenous toxin which promotes accumulation of DNA double strand breaks generated by gyrase, leading to replication arrest and cell death. The mechanism whereby QnrB1 mediates resistance is currently unknown.Here, an in vivo analysis of the interaction between QnrB1 and DNA gyrase in E. coli is presented. By using the pEVOL system, which is based on evolved Methanocaldococcus jannaschii aminoacyl-tRNA synthetase/suppressor tRNA pairs, it was possible to incorporate a photocrosslinking agent – p-benzoyl-L-phenylalanine (pBpa) into QnrB1. Exposure to UV of cells naturally expressing gyrase (without gyrase overexpression) and mutated QnrB1, leads to crosslinking and the crosslinked proteins can subsequently be identified using Western blotting techniques based on the presence of particular affinity tags. Several positions in QnrB1 which, after substitution with pBpa, are able to form crosslinks with gyrase proteins were identified and are observable as a band shift on blots. This work provides the first step towards finding the potential binding site of QnrB1 on DNA gyrase and understanding its mechanism of action