Specific antibody fragment ligand traps blocking FGF1 activity

Fibroblast growth factor 1 (FGF1) and its receptors (FGFRs) regulate crucial biological processes such as cell proliferation and differentiation. Aberrant activation of FGFRs by their ligands can promote tumor growth and angiogenesis in many tumor types, including lung or breast cancer. The development of FGF1-targeting molecules with potential implications for the therapy of FGF1-driven tumors is recently being considered a promising approach in the treatment of cancer. In this study we have used phage display selection to find scFv antibody fragments selectively binding FGF1 and preventing it from binding to its receptor. Three identified scFv clones were expressed and characterized with regard to their binding to FGF1 and ability to interfere with FGF1-induced signaling cascades activation. In the next step the scFvs were cloned to scFv-Fc format, as dimeric Fc fusions prove beneficial in prospective therapeutic application. As expected, scFvs-Fc exhibited significantly increased affinity towards FGF1. We observed strong antiproliferative activity of the scFvs and scFvs-Fc in the in vitro cell models. Presented antibody fragments serve as novel FGF1 inhibitors and can be further utilized as powerful tools to use in the studies on the selective cancer therapy

CA-170 : a potent small-molecule PD-L1 inhibitor or not?

CA-170 is currently the only small-molecule modulator in clinical trials targeting PD-L1 and VISTA proteins – important negative checkpoint regulators of immune activation. The reported therapeutic results to some extent mimic those of FDA-approved monoclonal antibodies overcoming the limitations of the high production costs and adverse effects of the latter. However, no conclusive biophysical evidence proving the binding to hPD-L1 has ever been presented. Using well-known in vitro methods: NMR binding assay, HTRF and cell-based activation assays, we clearly show that there is no direct binding between CA-170 and PD-L1. To strengthen our reasoning, we performed control experiments on AUNP-12 – a 29-mer peptide, which is a precursor of CA-170. Positive controls consisted of the well-documented small-molecule PD-L1 inhibitors: BMS-1166 and peptide-57

Discovery of inhibitory fragments that selectively target Spire2−FMN2 interaction

Here, we report the fragment-based drug discovery of potent and selective fragments that disrupt the Spire2–FMN2 but not the Spire1–FMN2 interaction. Hit fragments were identified in a differential scanning fluorimetry-based screen of an in-house library of 755 compounds and subsequently validated in multiple orthogonal biophysical assays, including fluorescence polarization, microscale thermophoresis, and 1H–15N HSQC nuclear magnetic resonance. Extensive structure–activity relationships combined with molecular docking followed by chemical optimization led to the discovery of compound 13, which exhibits micromolar potency and high ligand efficiency (LE = 0.38). Therefore, this fragment represents a validated starting point for the future development of selective chemical probes targeting the Spire2–FMN2 interaction

Małocząsteczkowe inhibitory oddziaływań : CD44-hiaruronian i MDM2-p53

Przedmiotem badań przedstawionych w rozprawie doktorskiej było poszukiwanie małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływań CD44-kwas hialuronowy oraz MDM2-p53. CD44 jest transbłonowym białkiem, występującym na powierzchni większości komórek oraz będącym bardzo ważnym elementem macierzy zewnątrzkomórkowej. Białko CD44 jest głównym receptorem kwasu hialuronowego. Jest pośrednikiem w stymulowaniu wielu procesów, takich jak: adhezja, agregacja, migracja, proliferacja komórkowa. Białko to bierze czynny udział w angiogenezie oraz jest przekaźnikiem sygnałów między macierzą zewnątrzkomórkową, a samą komórką. Dodatkowo jest odpowiedzialne za internalizację kwasu hialuronowego do wnętrza komórek oraz jego degradację. CD44 jest w znacznym stopniu zaangażowane w procesy wzrostu guzów nowotworowych oraz przerzutach nowotworowych. Jest również odpowiedzialne za oporność na radioterapię w przypadku nowotworu krtani i prostaty oraz zwiększoną oporność na chemioterapię w nowotworach trzustki i żołądka. Możliwość modulowania oddziaływania CD44-kwas hialuronowy inhibitorem farmakologicznym mogłaby mieć ogromne znaczenie w postępie onkologii. Do tej pory opublikowano bardzo niewiele prac pokazujących związki wykazujące oddziaływanie z białkiem CD44, które samo w sobie nie jest łatwym przedmiotem badań w tym kierunku, ze względu na płytką kieszeń wiążącą. Niniejsza praca przedstawia wyniki badań, w których zidentyfikowano cztery nowe fragmenty, wykazujące wiązanie się z CD44. Związki te mogą stanowić struktury wyjściowe dla potencjalnych inhibitorów tego receptora. Powinowactwo przedstawionych związków mieści się w zakresie milimolarnym, co jest typowe dla wiązania fragmentów. Charakterystykę wiązania się ww. związków dokonano za pomocą techniki NMR. W wyniku doświadczeń miareczkowania, wykonanych w obecności naturalnego liganda CD44- oktameru kwasu hialuronowego wykazano, że wiązanie się niektórych związków jest niezależne od wiązania się kwasu hialuronowego, tudzież w pozostałych przypadkach wiązanie CD44-oktamer kwasu hialuronowego, blokuje przyłączenie inhibitora. Badania te wskazują więc na więcej niż jedno miejsce wiązania inhibitorów, co może stanowić interesujący punkt wyjścia do opracowania nowych ligandów o wysokim powinowactwie. Na podstawie otrzymanych wyników przebadano 13 innych, podobnych strukturalnie związków. W badaniach zastosowano metody NMR i TSA. Żaden z wybranych związków nie wykazał oddziaływania z białkiem CD44. Przeprowadzono rozległe próby krystalizacji kompleksów białka CD44 z oktamerem kwasu hialuronowego i małocząsteczkowymi inhibitorami. W podjętych próbach nie uzyskano kryształów kompleksów, ale udało się otrzymać kryształy apo-CD44, którego strukturę rentgenowską rozwiązano. Celem krystalizacji białka CD44 było nasączanie kryształów potencjalnymi inhibitorami oraz oligomerami kwasu hialuronowego. Druga część mojej pracy opisuje przygotowanie i charakterystykę kilku oligomerów kwasu hialuronowego (HA6-HA12). Otrzymano je w reakcji trawienia polimeru HA o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW HA). Oktamer kwasu hialuronowego (HA8) został użyty zarówno do analizy oddziaływań CD44 z potencjalnymi inhibitorami jak również do syntezy koniugatów z małocząsteczkowymi inhibitorami oddziaływania białko-białko MDM2-p53. Koniugaty mogą stanowić innowacyjne podejście ułatwiające przenikanie inhibitorów małocząsteczkowych do komórek, poprzez zwiększenie ich rozpuszczalności i tym samym poprawę transportu małych cząsteczek do komórek nowotworowych. Podsumowując przedstawione badania przyczyniły się do odkrycia nowych małocząsteczkowych związków, które mogą być dalej rozwijane w potencjalne, silne inhibitory białka CD44.The subject of this doctoral dissertation is the search for small-molecule inhibitors of two oncogenic interactions: the CD44-hyaluronan interaction and the MDM2-p53 protein-protein interaction. The CD44 protein is a transmembrane receptor that is an important member of the extracellular matrix (ECM) which is present on the surfaces of most living cells. CD44 is a primary receptor for hyaluronic acid (HA). The protein is an intermediary for several stimulating processes such as adhesion, aggregation, migration, and cellular proliferation. CD44 takes also an active part in angiogenesis and is a signal transducer between the ECM and the cell itself. In addition, it is responsible for the internalization of hyaluronic acid inside the cells and its degradation. CD44 is heavily involved in growth processes of cancerous tumors and cancer metastases. It is also responsible for the resistance to radiotherapy in the case of larynx and prostate cancers and for the increased resistance to chemotherapy in pancreatic and gastric cancers. The possibility of modulating the interaction between CD44 and hyaluronic acid with a pharmacological small-molecule inhibitor could be of great importance in the fight against cancer. Very few reports have been published that describe the compounds that interact with the CD44 protein until today. CD44 in itself is not an easy target of research in this anticancer direction. This is due to the shallow HA-binding pocket in CD44. This thesis presents the results of the studies in which four new fragments were identified that show the binding to CD44. These compounds may constitute starting scaffolds for potential potent inhibitors of this receptor. The binding affinity of these compounds is in the millimolar range, which is typical for the fragments. NMR was used for characterization of binding of the compounds to CD44. Titrations experiments performed in the presence of a natural ligand of the CD44 - the octamer hyaluronic acid- showed that the binding of some of these compounds is independent of the binding of hyaluronic acid; and, in other cases, the binding of the CD44-octamer of hyaluronic acid to CD44 blocks the attachment of the inhibitor. These studies therefore indicate more than one site of these inhibitor bindings, which may be an interesting starting point for the development of novel higher affinity ligands for CD44. Based on the results obtained above, 13 structurally similar compounds were tested by NMR and the TSA methods. None of these compounds showed, however, any interaction with CD44. Extensive attempts have been made at crystallization of various complexes of CD44 with the hyaluronic acid octamer and CD44 with small-molecule inhibitors. These were not successful, although the crystals of the apo-CD44 were obtained and the X-ray structure of the apo-CD44 has been solved. The aim of crystallization of CD44 was obtaining the crystals of the apo-form of CD44 and next soaking them with potential small molecules or HA-derived binders. The second part of my thesis describes the preparation and characterization of several oligomers of HA (HA6 to HA12). These were obtained through digestion of the high molecular weight HA polymer (HMW HA). The HA octamer (HA8) was used both for analysis of CD44 interactions with potential small-molecule inhibitors and for the synthesis of the conjugates with the small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction. The conjugates may constitute an innovative approach to help small molecules enter the cell- by increasing their solubility- and by improving the transport of the small molecules into the cancer cells. In conclusion, the studies presented here have contributed to the discovery of new small-molecule binders to CD44 that may be further developed into the potential potent inhibitors of the CD44 protein

Projektowanie i synteza małocząsteczkowych inhibitorów białka USP2 metodą fragmentacji i kowalencyjnego dopasowania struktury substratu do kieszeni wiążącej USP2

Ubikwitynozależna proteoliza (UPS) jest główną drogą nielizosomalnej degradacji białek wewnątrzkomórkowych. UPS ma znaczącą rolę w różnych podstawowych procesach komórkowych, takich jak: regulacja cyklu komórkowego, podział komórki, rozwój i różnicowanie, apoptoza, regulacja przepuszczalności błony komórkowej i odpowiedzi immunologicznej. Przeprowadzono syntezę małocząsteczkowych związków będących potencjalnymi inhibitorami ligazy ubikwityny 2 (USP2), wykazującej ważną rolę w systemie UPS. W reakcji Ugi zsyntetyzowano cztery potencjalne, niekowalencyjne inhibitory. Aktywność biologiczna tych związków zostanie w najbliższym czasie zbadana metodą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego. Związkiem wyjściowym, niezbędnym do syntezy inhibitorów kowalencyjnych USP2 był N-acetonitrylo-2-izonitrylooacetamid. Jego synteza zakończyła się niepowodzeniem. Zaprojektowano i przetestowano więc nowe ścieżki syntezy, zakładające utworzenie grup nitrylowej i izonitrylowej w łańcuchu glicyloglicyny i amidu N-formyloglicyloglicyny, w reakcjach dehydratacji.The ubiquitin-proteasome system (UPS) is the major pathway of non-lysosomal proteolysis of intracellular proteins. The UPS plays essential roles in a variety of fundamental cellular processes such as regulation of cell cycle progression, division, development and differentiation, apoptosis, cell trafficking, and modulation of the immune and inflammatory responses. It was carried out the syntheses of small-molecule compounds that could be potential inhibitors of the ubiquitin specific peptidase 2 (USP2), an important protease of the UPS. Four noncovalent potential inhibitors were synthesized through the Ugi reaction. Binding of these compounds to USP2 will be checked by nuclear magnetic resonance techniques. The starting compound necessary for obtaining covalent inhibitors of USP2 was N-cyanomethane-2-isocyanoacetamide. The synthesis of this isonitrile was not successful. An alternative route was explored: this comprised generation of the nitrile and isonitrile groups in the glycylglycine chain and N-formylglycylglycinamide, followed by dehydratation reaction

Analysis tools for single-monomer measurements of self-assembly processes

Protein assembly plays an important role throughout all phyla of life, both physiologically and pathologically. In particular, aggregation and polymerization of proteins are key-strategies that regulate cellular function. In recent years, methods to experimentally study the assembly process on a single-molecule level have been developed. This progress concomitantly has triggered the question of how to analyze this type of single-filament data adequately and what experimental conditions are necessary to allow a meaningful interpretation of the analysis. Here, we developed two analysis methods for single-filament data: the visitation analysis and the average-rate analysis. We benchmarked and compared both approaches with the classic dwell-time-analysis frequently used to study microscopic association and dissociation rates. In particular, we tested the limitations of each analysis method along the lines of the signal-to-noise ratio, the sampling rate, and the labeling efficiency and bleaching rate of the fluorescent dyes used in single-molecule fluorescence experiments. Finally, we applied our newly developed methods to study the monomer assembly of actin at the single-molecule-level in the presence of the class II nucleator Cappuccino and the WH2 repeats of Spire. For Cappuccino, our data indicated fast elongation circumventing a nucleation phase whereas, for Spire, we found that the four WH2 motifs are not sufficient to promote de novo nucleation of actin

NMR fragment-based screening for development of the CD44-binding small molecules

The cell-surface protein CD44, a primary receptor for hyaluronic acid (HA), is one of the most promising targets for cancer therapies. It is prominently involved in the process of tumor growth and metastasis. The possibility of modulating the CD44-HA interaction with a pharmacological inhibitor is therefore of great importance, yet until now there are only few small molecules reported to bind to CD44. Here, we describe the results of the NMR fragment-based screening conducted against CD44 by which we found eight new hit compounds that bind to the receptor with the affinity in milimolar range. The NMR-based characterization revealed that there are two possible binding modes for these compounds, and for some of them the binding is no longer possible in the presence of hyaluronic acid. This could provide an interesting starting point for the development of new high-affinity ligands targeting the CD44-HA axis