Molekularbiologische Untersuchungen zum Wirkmechanismus des ppar-gamma Agonisten Piotglitazon auf die humanen Kolonkarzinom-Zelllinien HCT-116 und HT-29

Die Inzidenz des kolorektalen Karzinoms (KRK) hat seit 1975 ständig zugenommen und ist heute mit über einer Million Neuerkrankungen pro Jahr der dritthäufigste Tumor weltweit. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung des KRK von entscheidender Bedeutung. Eine dieser neuen Therapiemöglichkeiten könnte die Aktivierung des „peroxisome proliferator activated rezeptor“ (PPAR) durch Thiazolidindionen (TZDs) darstellen. TZDs, zu denen auch Pioglitazon gehört, umfassen eine Gruppe von Medikamenten, die ursprünglich zur Therapie des Diabetes Typ-II entwickelt wurden. In den letzten Jahren hat sich jedoch gezeigt, dass TZDs über die Aktivierung von PPAR-γ nicht nur einen antidiabetischen, sondern ebenfalls einen antiproliferativen Effekt auf diverse Tumorzellen besitzen. Um zu untersuchen, ob dies auch auf HCT-116 und HT-29 Zellen zutrifft, wurde zunächst die Expression von PPAR-γ in HCT-116 und HT-29 Zellen nachgewiesen. Die Inkubation der Zellen mit 40μM Pioglitazon führte in beiden Zelllinien zu einer deutlichen Reduktion des Zellwachstums unter Pioglitazon-Behandlung. Dieser antiproliferative Effekt war verbunden mit einer Erniedrigung der LDH-Aktivität, einem Marker für stattgefundenen Zelltod. Sowohl Wachstumshemmung als auch die Erniedrigung der LDH-Aktivität waren durch Blockade von PPAR-γ mittels des selektiven Inhibitor GW9662 reversibel, wodurch die PPAR-γ-Abhängigkeit der Pioglitazon-Wirkung auf das Wachstum von HCT-116 und HT-29 Zellen bewiesen werden konnte. Passend zu diesen Ergebnissen ergaben durchflusszytometrische Untersuchungen von HCT-116 Zellen eine nur mäßig gesteigerte Apoptoserate, wohingegen der Zellzyklus eine Arretierung der Zellen in der G0/G1-Phase aufwies. Dieser G0/G1-Arrest hatte eine verminderte Proteinexpression der am Zellzyklus beteiligten Enzyme cdk4, Cyclin D3 und p21cip1/waf1 zur Folge, wohingegen keine Regulation von pro-apoptotischen Enzymen wie Caspase 3, 9, 10 und p53 zu beobachten war. Untersuchungen zur Wechselwirkung zwischen der Pioglitazon-Wirkung und der TRAIL-vermittelten Apoptose zeigten in HT-29 Zellen einen synergistischen Effekt bei gleichzeitiger Inkubation der Zellen mit Pioglitazon und TRAIL, welcher sich bei den HCT-116 Zellen jedoch nicht nachweisen ließ. Interessanterweise fand sich unter Pioglitazon-Behandlung auch eine Erniedrigung der Proteinexpression von pdcd4, einem Tumorsupressor-Protein, welches über die Inhibition von eIF4A auf die Translation wirkt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Aktivierung von PPAR-γ einen Einfluss auf die Proteinexpression von pdcd4 besitzt. Der gleiche Effekt konnte bei der Inkubation von Jurkat-Leukämiezellen mit 40μM Pioglitazon nachgewiesen werden. Die stabile Transfektion von HCT-116 Zellen mit siRNA gegen pdcd4 resultierte ebenfalls in einer Wachstumshemmung, was die Vermutung nahe legt, dass ein basaler Proteinspiegel an pdcd4 für den normalen Ablauf des Zellwachstums unerlässlich ist. Zweidimensionale Gelelektrophoresen von HCT-116-Gesamtproteinextrakten zeigten eine Hyperphosphorylierung von Zytokeratin 19. Zytokeratine (CKs) gehören zu den Intermediärfilamenten und sind wichtiger Bestandteil des Zytoskeletts. Die Phosphorylierung ist eine wichtige regulatorische Modifikation für die Funktion von Zytokeratinen und erhöht deren Löslichkeit. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Behandlung mit TZDs zu einer vermehrten Phosphorylierung von CK 19 führt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Pioglitazon seinen wachstumshemmenden Effekt auf HCT-116 Zellen über die Erniedrigung der Proteinexpression von cdk4, Cyclin D3 und p21cip1/waf1 vermittelt, was einen G0/G1-Arrest zur Folge hat. Im Hinblick auf die Entwicklung neuer Strategien für die Behandlung von Karzinomen stellt somit die Aktivierung von PPAR-γ über TZDs oder andere, noch effektivere Agonisten eine Erfolg versprechende Therapieoption dar

Molekularbiologische Untersuchungen zum Wirkmechanismus des ppar-gamma Agonisten Piotglitazon auf die humanen Kolonkarzinom-Zelllinien HCT-116 und HT-29

Die Inzidenz des kolorektalen Karzinoms (KRK) hat seit 1975 ständig zugenommen und ist heute mit über einer Million Neuerkrankungen pro Jahr der dritthäufigste Tumor weltweit. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung des KRK von entscheidender Bedeutung. Eine dieser neuen Therapiemöglichkeiten könnte die Aktivierung des „peroxisome proliferator activated rezeptor“ (PPAR) durch Thiazolidindionen (TZDs) darstellen. TZDs, zu denen auch Pioglitazon gehört, umfassen eine Gruppe von Medikamenten, die ursprünglich zur Therapie des Diabetes Typ-II entwickelt wurden. In den letzten Jahren hat sich jedoch gezeigt, dass TZDs über die Aktivierung von PPAR-γ nicht nur einen antidiabetischen, sondern ebenfalls einen antiproliferativen Effekt auf diverse Tumorzellen besitzen. Um zu untersuchen, ob dies auch auf HCT-116 und HT-29 Zellen zutrifft, wurde zunächst die Expression von PPAR-γ in HCT-116 und HT-29 Zellen nachgewiesen. Die Inkubation der Zellen mit 40μM Pioglitazon führte in beiden Zelllinien zu einer deutlichen Reduktion des Zellwachstums unter Pioglitazon-Behandlung. Dieser antiproliferative Effekt war verbunden mit einer Erniedrigung der LDH-Aktivität, einem Marker für stattgefundenen Zelltod. Sowohl Wachstumshemmung als auch die Erniedrigung der LDH-Aktivität waren durch Blockade von PPAR-γ mittels des selektiven Inhibitor GW9662 reversibel, wodurch die PPAR-γ-Abhängigkeit der Pioglitazon-Wirkung auf das Wachstum von HCT-116 und HT-29 Zellen bewiesen werden konnte. Passend zu diesen Ergebnissen ergaben durchflusszytometrische Untersuchungen von HCT-116 Zellen eine nur mäßig gesteigerte Apoptoserate, wohingegen der Zellzyklus eine Arretierung der Zellen in der G0/G1-Phase aufwies. Dieser G0/G1-Arrest hatte eine verminderte Proteinexpression der am Zellzyklus beteiligten Enzyme cdk4, Cyclin D3 und p21cip1/waf1 zur Folge, wohingegen keine Regulation von pro-apoptotischen Enzymen wie Caspase 3, 9, 10 und p53 zu beobachten war. Untersuchungen zur Wechselwirkung zwischen der Pioglitazon-Wirkung und der TRAIL-vermittelten Apoptose zeigten in HT-29 Zellen einen synergistischen Effekt bei gleichzeitiger Inkubation der Zellen mit Pioglitazon und TRAIL, welcher sich bei den HCT-116 Zellen jedoch nicht nachweisen ließ. Interessanterweise fand sich unter Pioglitazon-Behandlung auch eine Erniedrigung der Proteinexpression von pdcd4, einem Tumorsupressor-Protein, welches über die Inhibition von eIF4A auf die Translation wirkt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Aktivierung von PPAR-γ einen Einfluss auf die Proteinexpression von pdcd4 besitzt. Der gleiche Effekt konnte bei der Inkubation von Jurkat-Leukämiezellen mit 40μM Pioglitazon nachgewiesen werden. Die stabile Transfektion von HCT-116 Zellen mit siRNA gegen pdcd4 resultierte ebenfalls in einer Wachstumshemmung, was die Vermutung nahe legt, dass ein basaler Proteinspiegel an pdcd4 für den normalen Ablauf des Zellwachstums unerlässlich ist. Zweidimensionale Gelelektrophoresen von HCT-116-Gesamtproteinextrakten zeigten eine Hyperphosphorylierung von Zytokeratin 19. Zytokeratine (CKs) gehören zu den Intermediärfilamenten und sind wichtiger Bestandteil des Zytoskeletts. Die Phosphorylierung ist eine wichtige regulatorische Modifikation für die Funktion von Zytokeratinen und erhöht deren Löslichkeit. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Behandlung mit TZDs zu einer vermehrten Phosphorylierung von CK 19 führt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Pioglitazon seinen wachstumshemmenden Effekt auf HCT-116 Zellen über die Erniedrigung der Proteinexpression von cdk4, Cyclin D3 und p21cip1/waf1 vermittelt, was einen G0/G1-Arrest zur Folge hat. Im Hinblick auf die Entwicklung neuer Strategien für die Behandlung von Karzinomen stellt somit die Aktivierung von PPAR-γ über TZDs oder andere, noch effektivere Agonisten eine Erfolg versprechende Therapieoption dar

Augmented Renal Vancomycin Clearance in Cancer Patients: A Case Report and Review of the Literature

Background: Bacterial infections are a major cause of morbidity and mortality in cancer patients. Particularly diagnostic and therapeutic procedures (e.g. central venous catheters, paracentesis) increase the risk of infections in this immunocompromised patient population. In the past, antibiotic therapy was empirically initiated in these patients, guided by treatment regimens designed for patients without malignancy; however, the hyperdynamic circulation in systemic inflammatory response syndrome, as well as the presence of malignancy itself, may have a crucial impact on treatment success. Case Report: Here, we report the case of a 55-year-old patient with advanced pancreatic cancer and Staphylococcus epidermidis bacteremia who, due to increased renal vancomycin clearance, required treatment with high doses of vancomycin in order to reach therapeutic trough levels. Conclusion: Oncological status can be a cofactor of altered pharmacokinetics in terms of a paraneoplastic syndrome. With the help of this case report we want to call attention to this clinically significant phenomenon with its inherent risk of inefficient antibiotic treatment

Effects of Helicobacter pylori Eradication in Chronic Spontaneous Urticaria: Results from a Retrospective Cohort Study

Background and Objective Helicobacter pylori (Hp) infection has been hypothesised to play a major role in the pathogenesis of chronic spontaneous urticaria (CSU). Despite only weak evidence from Hp eradication studies, screening for Hp infection is still recommended in several CSU guidelines. The aim of this study was to investigate the effect of Hp eradication in combination with standard CSU treatment in Hp-positive compared with Hp-negative patients, applying the latest guidelines for both diseases. Methods 138 consecutive patients with CSU were enrolled in this retrospective cohort study. All patients underwent gastroscopy and Hp status was determined by urease testing and histologic examination. Seventy-five patients were diagnosed as Hp negative and 47 patients fulfilled criteria for definite Hp infection, 45 of whom received eradication therapy. Sixteen patients who received eradication therapy without an appropriate indication served as the medication control. All patients received symptomatic treatment with antihistamines and/or glucocorticoids regardless of Hp status. Partial response (PR) was defined as subjective amelioration of CSU symptoms; patients returning for further CSU treatment within 6 months were considered non-responders/relapsers (NRs). Results The prevalence of Hp infection was comparable with Hp seroprevalence data reported for healthy western populations. Standard treatment of CSU led to relief of symptoms independent of Hp status. Hp eradication by standard triple therapy had no additional effect on PR (p = 0.32) or NR (p = 0.50). Conclusions Hp eradication has no discernible effect on CSU beyond that of standard CSU therapy. Therefore, Hp eradication should only be initiated in accordance with currently accepted indications of Hp treatment guidelines

Vital staining of blood vessels and bile ducts with carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester: a novel tool for isolation of cholangiocytes

Background and aim: Current methods for visualization of the blood vasculature, biliary tree and for isolation of vital cholangiocytes are afflicted with a plethora of technical difficulties, especially in mice. In this project, we propose a novel, reliable and straightforward alternative technique for histological demonstration of blood- and biliary systems and derivation of vital cholangiocytes. Methods: Intravital retrograde perfusion of bile ducts was performed in twenty wild type mice. Liver and gallbladder were exposed by median laparotomy. Using a venous catheter, the gallbladder was cannulated, a few millimeters of the liver edge were cropped to allow free outflow of the perfusate, and carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE) solution was retrogradely infused. Thereafter, formaldehyde solution was either injected through the same catheter, or the liver was immediately dissociated into a single-cell suspension for FACS-analysis. Intravital perfusion of the vascular system was performed in ten Lewis rats by direct intra-arterial injection of CFDA-SE into the abdominal aorta. The specificity and sensitivity of CFDA-SE labeling was controlled using Indian ink or cytokeratin 19 immunohistochemistry respectively. Results: Upon histomorphological analysis of cryoand paraffin sections, strong fluorescence was noted in large and small bile ducts throughout the entire liver and in the vascular system after infusion of the CFDA-SE solution. In preliminary FACS-experiments, we succeeded in separating cholangiocytes based on combined CFDA-SE-staining and cell size. Conclusions: Visualization of liver architecture and the isolation of cholangiocytes is feasible using a fast and cost-effective method of retrograde perfusion and vital fluorescent labeling of mouse bile duct epithelium and vascular endothelium with CFDA-SE

NEMO Prevents Steatohepatitis and Hepatocellular Carcinoma by Inhibiting RIPK1 Kinase Activity-Mediated Hepatocyte Apoptosis

I kappa B kinase/necrosis factor kappa B (IKK/NF-kappa B) signaling exhibits important yet opposing functions in hepatocarcinogenesis. Mice lacking NEMO in liver parenchymal cells (LPC) spontaneously develop steatohepatitis and hepatocellular carcinoma (HOC) suggesting that NF-kappa B prevents liver disease and cancer. Here, we show that complete NF-kappa B inhibition by combined LPC-specific ablation of RelA, c-Rel, and RelB did not phenocopy NEMO deficiency, but constitutively active IKK2-mediated NF-kappa B activation prevented hepatocellular damage and HCC in NEMOLPC-KO mice. Knock-in expression of kinase inactive receptor-interacting protein kinase 1 (RIPK1) prevented hepatocyte apoptosis and HCC, while RIPK1 ablation induced TNFR1-associated death domain protein (TRADD)-dependent hepatocyte apoptosis and liver tumors in NEMOLPC-KO mice, revealing distinct kinase-dependent and scaffolding functions of RIPK1. Collectively, these results show that NEMO prevents hepatocarcinogenesis by inhibiting RIPK1 kinase activity-driven hepatocyte apoptosis through NF-kappa B-dependent and -independent functions