6 research outputs found
Nmr relaxation studies on the hydrate layer of intrinsically unstructured proteins
Intrinsically unstructured/ disordered proteins (IUPs) exist in
a
disordered and largely solvent- exposed, still functional,
structural
state under physiological conditions. As their function is often
directly linked with structural disorder, understanding their
structure-function relationship in detail is a great challenge
to
structural biology. In particular, their hydration and residual
structure, both closely linked with their mechanism of action,
require
close attention. Here we demonstrate that the hydration of IUPs
can be
adequately approached by a technique so far unexplored with
respect to
IUPs, solid-state NMR relaxation measurements. This technique
provides
quantitative information on various features of hydrate water
bound to
these proteins. By freezing nonhydrate ( bulk) water out, we
have been
able to measure free induction decays pertaining to protons of
bound
water from which the amount of hydrate water, its activation
energy,
and correlation times could be calculated. Thus, for three IUPs,
the
first inhibitory domain of calpastatin, microtubule-associated
protein
2c, and plant dehydrin early responsive to dehydration 10, we
demonstrate that they bind a significantly larger amount of
water than
globular proteins, whereas their suboptimal hydration and
relaxation
parameters are correlated with their differing modes of
function. The
theoretical treatment and experimental approach presented in
this
article may have general utility in characterizing proteins that
belong
to this novel structural class
A szekurin-szeparáz rendszer szerkezeti-funkcionális jellemzése = Structural and functional characterisation of the securin-separase system
A munkaterv azt a célt tűzte ki, hogy a sejtciklusban fontos szerepet játszó szeparáz enzim és rendezetlen inhibítora (szekurin) részletes szerkezeti elemzésén keresztül közelebb jutunk a rendezetlen fehérjék funkciójának jobb megértéséhez. Ezen tervek nagyrészt megvalósultak, elsősorban a humán szekurin klónozását, és részletes szerkezeti jellemzését sikerült megoldanunk, ezen eredményeket két cikkben publikáltuk. Elkészültünk többféle szekurin (S. cerevisiae, D. melanogaster és humán) összehasonlító szerkezeti vizsgálatával is, ezen eredmények publikációja folyamatban van. A szeparáz enzim katalitikus doménjének klónozása sikerült, nagyszámú konstrukció készült és több is jól kifejeződő fehérjét eredményezett, amelyek aktivitását azonban nem tudtuk mérni. A munkát folytatjuk, folyamatban van egyrészt a fehérje különböző körülmények közötti kifejezése, denaturációja és renaturációja, és aktív formában való előállítása, másrészt nemzetközi együttműködésben Prof. Darren Hart-tal (EMBL Grenoble) az ESPRIT (Expression of Soluble Proteins by Random Incremental Truncation) könyvtár-szűrési technika alkalmazása oldható és aktivitást mutató szeparáz konstrukció létrehozására. A fehérjék szerkezeti rendezetlenségének vizsgálata eközben számos más területeken is hatékonyan folyt, az OTKA K60694 pályázat támogatásának összesen 19 publikáció jelent meg. | The main goal of the proposed work was the detailed structure-function characterization of separase, a key enzyme in cell-cycle regulation and its intrinsically disordered inhibitor, securin. We planned to clone and isolate the two proteins, characterize their structure and interaction with particular focus on the disordered structural state of securin. We achieved part of this goal, mostly the cloning, expression and structural characterization by NMR of human securin, which was published in two papers. We also completed the comparative structural study of three different securins (S. cerevisiae, D. melanogaster and human), which is under publication. We managed to clone and express several constructs of the catalytic domain of separase, which resulted in soluble forms of the protein, without enzymatic activity, though. We continue this research by varying expression conditions, including denaturation-renaturation cycles to produce active separase, and also by an international collaboration with Prof. Darren Hart-tal (EMBL Grenoble) with the application of the ESPRIT (Expression of Soluble Proteins by Random Incremental Truncation) technique in order to generate enzymatically active separase. Besides studies on the securin-separase system, we have carried out many other lines of productive research on intrinsically disordered proteins with the help of OTKA K60694 grant: we published 19 papers with acknowledging the grant
Rendezetlen fehérjék: a szerkezet-funkció paradigma kiterjesztése = Intrinsically disordered proteins: extension of the structure-function paradigm
Kísérletes eredmények: Rendezetlen chaperonok hatása, a riboszomális fehérjék kettős chaperone hatásának kimutatása. A rendezetlen fehérjék ellenállnak a hideg-denaturációnak. A rendezetlen fehérjéknek egyedi a hidratációja. Rendezetlenség kimutatása liofilizált mintákból. A rendezetlenség korrelál a kromoszómális transzlokációval. Az állványfehérjéknek magas a rendezetlensége. Új NMR technika a rendezetlen fehérjék elemzésére. Az ERD14 NMR jelhozzárendelése és szerkezeti-dinamikai jellemzése. Az androgén receptor rendezetlen régiójának hossza kapcsolatban van a kognitív képességekkel. A rendezetlen fehérjék crowding körülmények között sem tekerednek fel. Elméleti megfigyelések: Kötött állapotban megfigyelhető rendezetlenség (bolyhsosság) elemzése, a domén koncepció kiterjesztése a rendezetlenségre, az amiloidokban mutatkozó rendezetlenség leírása. Bioinformatikai eredmények: A hipertermofil baktériumokban a rendezetlenség aránya alacsony. Az alternatív splicing során kialakuló kettős kódolású szakaszokról átíródó fehérjék rendezetlensége teszi lehetővé az alternatív fehérjék létét. A rendezetlenség közvetlen kapcsolatban van a fehérje funkciójával, így harmadlagos szerkezeti elemnek tekinthető. Predikciós módszer kidolgozása az alternatív splicing során létrejövő fehérje életképességének megállapítására. A poty-vírus VPg sokféle funkcióban vesz részt, köszönhetően szerkezeti flexibilitásának. Egyéb eredmények: Review a rendezetlenség kutatásának új szakaszáról. | Experimental results: Study of the disordered chaperones, the determination of the double chaperone effect of ribosomal proteins, resistance of the IDPs to cold denaturation. Determination of the unique hydration of IDPs. Determination of protein disorder from lyophilized samples. Protein disorder correlates with chromosomal translocation. Scaffold proteins contain a high level of structural disorder. Designing a new NMR method for the study of IDPs. Assignation of NMR signals of ERD14 and its structural-dynamics characterization. The observation that the length of the disordered region of androgen receptor is related to cognitive capabilities. IDPs remain unfolded even under crowding conditions. Theoretical observations: Analysis of disorder in the bound form (fuzziness), extending the domain concept to IDPs, description for disorder in amyloids. Bioniformatical results: Observation of low levels of disorder in hyperthermophil bacteria. Alternative protein forms are able to evolve because of the disordered nature of the transcripts of dual coding sequences, that result from alternative splicing. Disorder is in intimate connection to function, thus it should come under the category of tertiary structural elements. Designing a prediction method to determine the viability of a protein from an alternative splice event. The VPg protein of poty virus possesses many different functions, thanks to its structural flexibility. Other results: Review of the new era of disorder research
Primary Contact Sites in Intrinsically Unstructured Proteins: The Case of Calpastatin And Microtubule-associated Protein 2
Intrinsically unstructured proteins (IUPs) exist in a disordered
conformational state, often considered to be equivalent with the
random-coil structure. We challenge this simplifying view by
limited proteolysis, circular dichroism (CD) spectroscopy, and
solid-state H-1 NMR, to show short- and long-range structural
organization in two IUPs, the first inhibitory domain of
calpastatin (CSD1) and microtubule-associated protein 2c
(MAP2c). Proteases of either narrow (trypsin, chymotrypsin, and
plasmin) or broad (subtilisin and proteinase K) substrate
specificity, applied at very low concentrations, preferentially
cleaved both proteins in regions, i.e., subdomains A, B, and C
in CSD1 and the proline-rich region (PRR) in MAP2c, that are
destined to form contacts with their targets. For CSD1,
nonadditivity of the CD spectra of its two halves and suboptimal
hydration of the full-length protein measured by solid-state NMR
demonstrate that long-range tertiary interactions provide the
structural background of this structural feature. In MAP2c, such
tertiary interactions are absent, which points to the importance
of local structural constraints. In fact, urea and temperature
dependence of the CD spectrum of its PRR reveals the presence of
the extended and rather stiff polyproline II helix conformation
that keeps the interaction site exposed. These data suggest that
functionally significant residual structure exists in both of
these IUPs. This structure, manifest as either transient local
and/or global organization, ensures the spatial exposure of
short contact segments on the surface. Pertinent data from other
IUPs suggest that the presence of such recognition motifs may be
a general feature of disordered proteins. To emphasize the
possible importance of this structural trait, we propose that
these motifs be called primary contact sites in IUPs