Avaliação de variantes polimórficas em genes envolvidos em apoptose e seus papéis na suscetibilidade e progressão clínica da doença falciforme

Base teórica: A anemia falciforme (AF) é uma doença monogênica e hereditária, caracterizada pelas crises dolorosas e inflamação crônica. O estado inflamatório da AF resulta em uma elevação crônica de leucócitos (neutrófilos), macrófagos (monócitos), devido ao aumento das hemacias falciformes com a apresentação da fosfatidilserina na circulação sanguinea. A apoptose ou morte celular programada é um mecanismo celular conhecido por manter o equilibrio homeostático durante a inflamação. Algum defeito nesse mecanismo, pode contribuir para o progresso clínico da doença inflamatória, como AF. Objetivo: Desta forma, o presente estudo tem como principal objetivo, investigar o perfil genético de pacientes com AF através da análise da presença e frequência de variantes polimórficas em genes associados a apoptose, comparando estes dados com indivíduos controles. Métodos: Foram extraídas 138 Amostras de DNA a partir de sangue periférico de pacientes com AF. As amostras foram amplificadas e genotipadas para os SNPs associados a apoptose (FAS-1337G / A, FAS-670A / G, BCL-2 -938C / A, BAX-248G / A) usando PCR e enzima de restrições especificas. Calculamos as frequências alélicas e genotipicas para cada SNP e comparamos com o grupo controle. Resultados: Diferenças estatisticamente significativas (p> 0,001) foram observadas entre as frequências genotípica e alélica dos outros três polimorfismos (FAS -670G / A, BCL-2 -938C / A e BAX-248G / A) em comparação com o grupo de controle. Por outro lado, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas (p> 0,05) entre as frequências genotípicas e alélicas em relação ao polimorfismo FAS -1377 G / A. Conclusão: Nosso estudo mostrou, que existem associações entre as variantes FAS-670G, BCL2 -938C e BAX -248A e a AF, e que a expressão destesgenes potencialmente pode ser correlacionada a fatores modificadores da doença.Backgroun: Sickle cell anemia (SCA) is a monogenic and hereditary disease characterized by painful crises and chronic inflammation. The inflammatory state of SCA results in a chronic elevation of leukocytes (neutrophils), macrophages (monocytes), associated to an increase in sickle red cells with the presentation of phosphatidylserine in the bloodstream. Apoptosis or programmed cell death is a cellular mechanism known to maintain homeostatic balance during inflammation. Any defect in this mechanism may contribute to the clinical progress of inflammatory disease, such as SCA. Objective: This study has as main objective to investigate the genetic profile of patients with SCA through the analysis of the presence and frequency of polymorphic variants in genes associated with apoptosis, comparing these data with control individuals Methods: DNA samples were extracted from peripheral blood of 138 patients with SCA. The samples were amplified and genotyped for SNPs in apoptosis related genes (FAS-1337G/ A, FAS-670A / G, BCL 2 -938C/A, BAX-248G / A) using PCR and specific restriction enzymes. We calculated the allelic and genotypic frequencies for each SNP and compared with the control group. Results: Statistically significant differences (p>0.001) were observed between the genotypic and allelic frequencies of the other three polymorphisms (FAS -670G / A, BCL-2 -938C / A e BAX-248G / A) compared with control group. On the other hand, no statistically significant differences (p>0.05) between genotypic and allelic frequencies concerning the FAS -1377 G/A polymorphism were observed. Conclusion: Our study showed for the first time some associations between the FAS-670G, BCL-2 -938C and BAX -248A variants and SCA, suggesting that the expression of such genes can constitute disease modifying factors

Estabelecimento de linhagem de glioblastoma humano resistente ao quimioterápico temozolomida

A reincidência tumoral está geralmente associada a resistência ao tratamento quimioterápico, onde estão envolvidas respostas adaptativas, alterações genéticas surgidas durante o tratamento, aumento da expressão do alvo terapêutico, ativação de vias alternativas de sinalização e vários outros mecanismos ainda desconhecidos. Linhagens de células tumorais resistentes são desenvolvidas in vitro para investigar e entender os potencias mecanismos de reincidência tumoral. Entretanto, a grande maioria desses modelos não se assemelham as condições clínicas durante a quimioterapia. O presente estudo visa estabelecer um protocolo experimental de resistência tumoral ao Temozolomida (TMZ), onde linhagem de célula glioblastoma U87-MG foram exposta um regime de tratamento similar ao regime clinico padrão com TMZ, na tentativa de obter um modelo in vitro de quimio-resistência clinicamente relevante. As células foram expostas ao TMZ em duas fases. Na primeira fase as células foram cultivadas com 18μM de TMZ cada 48h por um período de 22 dias, seguido de 4 semanas sem exposição ao fármaco. Já na segunda fase do tratamento, as células foram expostas diariamente a 25 μM de TMZ durante 5 dias, seguido de 4 semanas sem exposição ao TMZ. As células controles seguiram o mesmo regime de exposição, mas foram cultivadas com DMSO 0,5%. A resistência das células foi testada tratando-as com concentrações crescentes de TMZ por 72h. A quantidade de células após tratamento foi mensurada através do ensaio do SRB. Comparando as células cultivadas com TMZ e DMSO, observamos que não há diferenças significativas no nível de resistência das células ao quimioterápico. Porém diferenças morfológicas, assim como presenças de vesículas extracelulares, foram observadas nas células previamente expostas ao TMZ, o que sugere provável reposta adaptativa das células ao quimioterápico.Tumor recurrence is usually associated with resistance to chemotherapy and probably caused by adaptative responses, genetic alterations developed during treatment, increase in the expression of therapeutic targets, activation of alternative signaling pathways and other unknown mechanisms. Chemoresistant cell lineages are developed in vitro as models to investigate and understand the potential mechanisms behind tumor recurrence. However, the majority of these models do not resemble to conditions experienced by patients during chemotherapy. The goal of this work is to develop an in vitro protocol of clinically relevant tumor resistance to Temozolomida (TMZ). The glioblastoma cell lineage U87-MG was exposed to a regime of treatment similar to the clinical standard regime with TMZ. Cells were exposed to TMZ in two phases. In the first phase, the cells were exposed to 18μM TMZ every 48h for 22 days, followed by 4 weeks without treatment. In the second phase, cells were daily exposed to 25 μM TMZ during 5 days, followed by 4 weeks without treatment. Control cells followed the same protocol of exposition, but were cultivated with DMSO 0,5%. The chemoresistance were tested by treating the exposed cells with increasing concentrations of TMZ for 72h. With SRB assay, we measured the quantity of cells after treatment. Comparing the cells cultivated with TMZ and DMSO, we observed no significant differences in the TMZresistance level between the cells. However, we observed morphological changes and presence of extracellular vesicles in the cells previously exposed to TMZ, indicating an adaptative response of these cells to the drug

Estabelecimento de linhagem de glioblastoma humano resistente ao quimioterápico temozolomida

A reincidência tumoral está geralmente associada a resistência ao tratamento quimioterápico, onde estão envolvidas respostas adaptativas, alterações genéticas surgidas durante o tratamento, aumento da expressão do alvo terapêutico, ativação de vias alternativas de sinalização e vários outros mecanismos ainda desconhecidos. Linhagens de células tumorais resistentes são desenvolvidas in vitro para investigar e entender os potencias mecanismos de reincidência tumoral. Entretanto, a grande maioria desses modelos não se assemelham as condições clínicas durante a quimioterapia. O presente estudo visa estabelecer um protocolo experimental de resistência tumoral ao Temozolomida (TMZ), onde linhagem de célula glioblastoma U87-MG foram exposta um regime de tratamento similar ao regime clinico padrão com TMZ, na tentativa de obter um modelo in vitro de quimio-resistência clinicamente relevante. As células foram expostas ao TMZ em duas fases. Na primeira fase as células foram cultivadas com 18μM de TMZ cada 48h por um período de 22 dias, seguido de 4 semanas sem exposição ao fármaco. Já na segunda fase do tratamento, as células foram expostas diariamente a 25 μM de TMZ durante 5 dias, seguido de 4 semanas sem exposição ao TMZ. As células controles seguiram o mesmo regime de exposição, mas foram cultivadas com DMSO 0,5%. A resistência das células foi testada tratando-as com concentrações crescentes de TMZ por 72h. A quantidade de células após tratamento foi mensurada através do ensaio do SRB. Comparando as células cultivadas com TMZ e DMSO, observamos que não há diferenças significativas no nível de resistência das células ao quimioterápico. Porém diferenças morfológicas, assim como presenças de vesículas extracelulares, foram observadas nas células previamente expostas ao TMZ, o que sugere provável reposta adaptativa das células ao quimioterápico.Tumor recurrence is usually associated with resistance to chemotherapy and probably caused by adaptative responses, genetic alterations developed during treatment, increase in the expression of therapeutic targets, activation of alternative signaling pathways and other unknown mechanisms. Chemoresistant cell lineages are developed in vitro as models to investigate and understand the potential mechanisms behind tumor recurrence. However, the majority of these models do not resemble to conditions experienced by patients during chemotherapy. The goal of this work is to develop an in vitro protocol of clinically relevant tumor resistance to Temozolomida (TMZ). The glioblastoma cell lineage U87-MG was exposed to a regime of treatment similar to the clinical standard regime with TMZ. Cells were exposed to TMZ in two phases. In the first phase, the cells were exposed to 18μM TMZ every 48h for 22 days, followed by 4 weeks without treatment. In the second phase, cells were daily exposed to 25 μM TMZ during 5 days, followed by 4 weeks without treatment. Control cells followed the same protocol of exposition, but were cultivated with DMSO 0,5%. The chemoresistance were tested by treating the exposed cells with increasing concentrations of TMZ for 72h. With SRB assay, we measured the quantity of cells after treatment. Comparing the cells cultivated with TMZ and DMSO, we observed no significant differences in the TMZresistance level between the cells. However, we observed morphological changes and presence of extracellular vesicles in the cells previously exposed to TMZ, indicating an adaptative response of these cells to the drug

Complexação do carvacrol com beta-ciclodextrina e avaliação de potencial farmacológico em modelo in vivo

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