Interrelación entre alfa-sinucleína y Tau en separación de fases líquido-líquido.

Nuestra comprensión sobre algunas enfermedades neurodegenerativas amiloides, tales como la enfermedad de Parkinson o de Alzheimer, es todavía muy limitada. La observación reciente en pacientes de la co-agregación de Tau (proteína tradicionalmente implicada en enfermedad de Alzheimer) y α-sinucleina (relacionada con la enfermedad de Parkinson) eleva la complejidad de la situación y pone de manifiesto la posible interacción entre ambas proteínas y, por tanto, su co-agregación y toxicidad.Recientemente se ha reportado la agregación de Tau en neuronas provocada por un proceso electrostático de coacervación simple que lleva a un proceso de separación de fases líquido-líquido y, posteriormente, líquido-a-sólido. En este trabajo estudiaremos la relación entre α-sinucleina y Tau y determinaremos que ambas proteínas son capaces de sufrir procesos electrostáticos de coacervación compleja en una solución in vitro. Estos resultados demuestran que α-sinucleina co-dirige este proceso y no se limita a ser una mera proteína cliente como se había propuesto anteriormente. Esta interrelación entre ambas proteínas radica en las interacciones electrostáticas entre la región cargada negativamente C-terminal de α-sinucleina y la región cargada positivamente de Tau. Curiosamente, los coacervados generados por ambas proteínas sufren un proceso de maduración a lo largo del tiempo que conlleva una transición líquida a sólido y la formación de agregados amiloides, con ambas proteínas co-localizando, dentro de los coacervados fusionados. Nuestros resultados sugieren que la separación de fases de Tau y α-sinucleina podría ser el evento patológico que provoca la co-agregación de ambas proteínas descrita en algunas enfermedades.<br /

Novel fluorescence-based tools and applications for characterizing emerging pathways of α-synuclein amyloid aggregation, disaggregation and inhibition

Habitualmente se denomina agregación amiloide a aquel proceso de malplegamiento proteico que comprende la transición de una proteína soluble y funcional a especies oligoméricas intermedias y, en última instancia, fibras insolubles con una estructura característica llamada de lámina β cruzada. Varias enfermedades neurodegenerativas se encuentran asociadas a este proceso, entre las que se encuentra la enfermedad de Párkinson (PD en inglés). Esta se caracteriza por unos depósitos intracelulares, denominados cuerpos o neuritas de Lewy, ricos en α-sinucleína (αS) en forma de agregados amiloides. αS es una proteína intrínsecamente desordenada de 140 aminoácidos que se expresa ampliamente en el cuerpo humano, especialmente en el sistema nervioso central. Su agregación amiloide también está vinculada con otras sinucleinopatías como demencia con cuerpos de Lewy, atrofia sistémica múltiple y enfermedad de Alzheimer (AD en inglés). A pesar de que los factores que provocan el autoensamblado amiloide de αS in vivo son desconocidos, algunos estudios in vitro son capaces de reproducir tal agregación. Habitualmente, lo hacen mediante el uso de interfases de carácter hidrofóbico/hidrofílico que catalizan los primeros contactos entre proteínas en un proceso llamado nucleación primaria. Las estructuras amiloides formadas mediante este mecanismo de nucleación heterogénea poseen una disposición inter-molecular paralela. En este trabajo, hemos logrado inducir y analizar el autoensamblado amiloide de αS en ausencia de interfases bajo condiciones de hidratación limitada. La agregación ocurre en el seno de la disolución mediante una nucleación, por tanto, homogénea. Mediante el empleo de la espectroscopia de fluorescencia de pireno hemos demostrado que, siguiendo este nuevo mecanismo de nucleación, los agregados adoptan una topología antiparalela. Además, hemos observado que este tipo de nucleación podría estar favorecida en el interior de condensados biomoleculares de αS generados a través de separación de fases líquido líquido (LLPS en inglés), donde la hidratación de la proteína se ve reducida. Aplicando una combinación de técnicas biofísicas, hemos estudiado cuantitativamente la capacidad de αS y de la proteína Tau para sufrir LLPS. Entre estas técnicas, hemos empleado microscopía de tiempo de vida fluorescente (FLIM en inglés), al nivel de condensados individuales, para demostrar la maduración en el tiempo de estos, gracias a la exquisita resolución temporal y espacial de FLIM. Hemos descubierto que αS y Tau sí forman condensados biomoleculares mixtos y que, con el tiempo, forman heteroagregados amiloides en el interior de estos coacervados mediante la denominada transición de fases líquido-solido (LSPT en inglés). Cabe destacar que hemos esclarecido que el principal factor que regula esta LSPT es la valencia y ocupación de las interacciones heterotípicas,y no la dinámica de las cadenas polipeptídicas como se ha descrito frecuentemente paraotros sistemas. Nuestros resultados ayudan a establecer un escenario relevante para la co-agregación de ambas proteínas que podría explicar el hecho de que se observen, conjuntamente, tanto en PD como en AD. Además, hemos contribuido al campo de LLPS-LSPT proporcionando una descripción detallada y cuantitativa de sistemas αS/policatión con técnicas avanzadas y complementarias, incluyendo el estudio de coacervados individuales. Esto podría servir como base para el estudio de una amplia variedad de condensados biomoleculares y de especial interés para caracterizar la relación entre estos y la agregación amiloide.Por otra parte, encontrar moléculas con potencial terapéutico o diagnóstico en enfermedades neurodegenerativas es de una importancia extrema. Sin embargo, la complejidad y heterogeneidad en el paisaje conformacional de la agregación amiloide hacen de esta una diana destacablemente complicada para los estudios habituales de cribado de fármacos basados en ensayos de interacción molecular. En esta tesis hemos establecido una estrategia experimental que combina la espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia y la espectroscopia de fluorescencia de partícula individual de dos colores (dcFCCS/dcSPFS en inglés), y la hemos empleado para investigar la unión de pequeñas moléculas a especies amiloides neurotóxicas de αS con resolución de partícula individual y con independencia de las heterogeneidades moleculares del sistema de estudio. Gracias a la observación de los eventos de interacción de uno en uno, hemos resuelto de manera directa la especificidad, afinidad y estequiometría de unión de varios pequeños péptidos inhibidores de la agregación amiloide de αS, entre los cuales se incluye un péptido humano. Hemos descrito en detalle su mecanismo molecular de actuación y desentrañado las propiedades físico-químicas que respaldan la interacción, contribuyendo al diseño racional de otros péptidos candidatos a fármaco.El uso dcFCCS/dcSPFS puede ampliarse a otras situaciones de interacción multiligando/ receptor multimérico y convertirse en una plataforma experimental para el descubrimiento de nuevos fármacos y marcadores diagnósticos específicos de amiloide. Por último, además de inhibir el proceso de autoensamblado, la desagregación de fibras amiloides puede ser una herramienta para combatir la neurodegeneración. Dentro de las células, esta tarea es llevada a cabo sobre fibras de αS por una maquinaria especializada de chaperonas conocida como la desagregasa humana. Sin embargo, el mecanismo preciso por el cual este complejo proteico procesa las fibras, así como el posible vínculo entre la toxicidad y estructura de un agregado y la actividad desagregasa sobre el mismo es un tema todavía bajo intenso debate. Uno de los principales retos es la obtención de datos cinéticos fiables y de calidad de la reacción de desensamblado, debido a artefactos de la técnica más extensamente usada: la fluorescencia de la sonda tioflavina-T. En nuestro trabajo hemos aplicado la fluorescencia de pireno junto con la desextinción de fluorescencia para afrontar este problema. Hemos logrado probar un mecanismo de desagregación de todo o nada, por el cual cada fibra se desensambla y libera monómeros solubles de αS mediante un mecanismo de cremallera. Nuestros datos cinéticos han permitido el modelado cuantitativo del mecanismo de desagregación sobre diferentes estructuras amiloides de αS. Estos resultados han revelado que, probablemente, la desagregasa humana ha evolucionado para actuar específicamente sobre agregados pequeños y citotóxicos.En resumen, hemos implementado nuevas herramientas y aplicaciones de fluorescencia, incluyendo técnicas de fluorescencia resueltas en el tiempo y de partícula única de dos colores, para el estudio detallado de la agregación amiloide, transición de fases, inhibición y desagregación de αS. En conjunto, nuestros resultados contribuyen a responder preguntas clave de la agregación amiloide de αS y de la búsqueda de estrategias terapéuticas contra las sinucleinopatías. Además, los enfoques experimentales presentados en esta tesis se pueden aplicar para comprender y actuar sobre otros sistemas amiloides, siendo por tanto herramientas metodológicas relevantes en el campo de la agregación amiloide y la neurodegeneración.Amyloid aggregation is typically referred to as a protein misfolding process involving the transition from a functional, soluble protein into oligomeric intermediates and, eventually, insoluble fibrils with a hallmark cross-β structure. A number of neurodegenerative diseases are associated to this process, including Parkinson’s disease (PD), which is characterized by intracellular deposits rich in α-synuclein (αS) in the form of amyloid aggregates, which are referred to as Lewy bodies (LB) or neurites. αS is an intrinsically disordered 140-aminoacid protein widely expressed throughout the body, particularly in the central nervous system. Its amyloid aggregation is also associated with other synucleinopathies such as dementia with Lewy bodies (DLB), multiple system atrophy (MSA) or Alzheimer’s disease (AD). While the factors triggering the amyloid self-assembly of αS in vivo are still obscure, in vitro studies are able to reproduce the aggregation, typically using hydrophobic/hydrophilic interfaces to trigger the first protein-protein contacts, a process termed primary nucleation. The amyloid structures resulting from this (heterogeneous) nucleation show a parallel inter-molecular arrangement. In this work, we were able to induce and analyze the amyloid self-assembly of αS in the absence of interfaces in the bulk of the solution (homogeneous nucleation) under limited hydration conditions. By using pyrene fluorescence spectroscopy we proved that, via this new type of nucleation, the aggregates adopt an antiparallel topology. Moreover, we have observed that this type of nucleation could be favorable in the interior of αS condensates generated by liquid-liquid phase separation (LLPS). By using a combination of biophysical techniques, we quantitatively interrogated the ability of αS and the protein Tau to undergo LLPS. Among these techniques, we used fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) down to the single-coacervate level, to resolve their maturation without ambiguity, owing to the exquisite temporal and spatial resolution of FLIM. We found that, indeed, αS and Tau form mixed biomolecular condensates by complex elecotrostatic coacervation and, over time, they form amyloid heteroaggregates through liquid-to-solid phase transition (LSPT) in the interior of the condensates. Interestingly, we proved that the valence and occupancy of the heterotypic interactions, and not the polypeptide dynamics, are the main factor governing LSPT. Our results help establishing a relevant scenario for the co-aggregation of both proteins which could explain their joint presence in both PD and AD. Besides, we have contributed to the LLPS-LSPT field by providing a thourough, quantitative description of αS/polycation systems with advanced and complementary techniques and by looking at single coacervates. This could serve as a framework to be used in a wide array of biomolecular condensates, and of particular interest for characterizing the link between these and amyloid aggregation. Finding molecules with therapeutic or diagnosic potential in neurodegenerative disorders is of utter importance. However, the complexity and heterogeneity of the amyloid conformational landscape, makes amyloid aggregation a tremendously challenging target for typical drug screens based in molecular interaction assays. Here, we established an experimental strategy which combines dual-color fluorescence correlation spectroscopy and single-particle fluorescence spectroscopy (dcFCCS/dcSPFS) to investigate the binding of small molecules to amyloid species of αS with single-particle resolution and regardless of molecular heterogeneity. By observing binding events individually, we gained direct access to the binding specificity, affinity and stoichiometry of several small amyloid inhibitory peptides, including a human peptidic molecule. We demonstrated its molecular mechanism of action and disentangled the minimum physico-chemical properties behind the binding properties, thus aiding in the rational design of other peptide drug candidates. dcFCCS/dcSPFS could be extended to other multi-ligand/multimeric receptor interaction scenarios and serve as a platform for finding new drugs and amyloid-specific diagnostic probes. Besides inhibiting the self-assembly process, the disaggregation of amyloid fibrils can be a tool for fighting neurodegeneration. In the cell, such task is performed on αS fibrils by an evolutionary refined chaperone machinery termed the human disaggregase. However, the exact mechanism by which this proteic complex processes the fibrils as well as what is the relationship between aggregate toxicity, structure and disaggregase activity remains under debate. A major challenge is to obtain reliable kinetic data of the disassembly reaction due to artifacts related to the most commonly used amyloid probe, thioflavin-T (ThT). In our work, we have applied pyrene fluorescence together with fluorescence dequenching to solving this problem. We demonstrated an all-or-none disassembly mechanism, where a fibril disassembles entirely into soluble monomers by an unzipping mechanism. Our kinetic data enabled to quantitatively model the disaggregation mechanism on different amyloid assemblies of αS. Our results revealed that the chaperone machinery has likely evolved to tackle small cytotoxic aggregates specifically. In summary, we have implemented new fluorescence-based tools and applications, including time-resolved and single-particle dual-color fluorescence techniques, to the detailed investigation of amyloid aggregation, phase separation, inhibition and disaggregation of αS. Collectively, our results help to understand key questions of αS amyloid aggregation and potential therapeutic strategies against synucleinopathies. In addition, the experimental approaches presented in this thesis can be also easily extended to understand and tackle other amyloid systems, representing important methodological tools in the fields of amyloid aggregation and neurodegeneration.<br /

Estudio de las propensidades estructurales de la sequencia de alfa sinucleína

The amyloid aggregation of alpha synuclein (αS), an intrinsically disordered protein, plays a key role in the etiology of Parkinson disease. The molecular mechanisms of αS amyloid aggregation are not well described at the moment and in this research, we move the first steps towards the characterization of two different mechanisms of αS aggregation as well as the of the phase transition between them using methanol (MetOH) as an inducing agent, with an approach that will combine the experimental and theoretical perspective with a residues-based theoretical modelling.On the one hand the determination of the phase transition range between the two observed mechanisms was carried out by performing αS aggregation kinetics at different MetOH concentrations and carrying out structural analysis of the generated aggregates by Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). On the other hand, the preference for one mechanism or the other was studied with pyrene excimer emission fluorescence spectroscopy and the coexistence of both types of aggregation mechanisms was observed in the transition phase. The results obtained from FTIR and emission fluorescence spectroscopy were in agreement and complementary to each other.From the theoretical perspective an initial approach for the αS aggregation modelling was given by computing the accuracy of online secondary structure predictors in order to determine the importance of different αS amino acid regions in the preference for the type of amyloid aggregation mechanism. <br /

Estudio de la agregación amiloide de alfa-sinucleína por transformación líquido-sólido de gotas de proteína generadas por separación de fases

La enfermedad de Parkinson está ligada a la agregación amiloide de alfa-sinucleína (αS) en las neuronas. Cómo se origina este proceso aún no está claro. Actualmente la hipótesis de que la formación de condensados biomoleculares de αS generados por separación de fases líquido-líquido (LLPS) puede ser un paso previo para la agregación amiloide de la proteína in vivo, a través de un proceso de transición de líquido a sólido (LSPT) de los condensados, cobra cada vez más fuerza. Así, recientes investigaciones tratan de reproducir este proceso in vitro. En este trabajo estudiamos los factores que afectan a los procesos LLPS y LSPT empleando condiciones de formación de condensados biomoleculares de αS in vitro ya descritas, con el fin de aumentar la compresión de este proceso y elucidar la implicación de las distintas regiones de αS en ambos procesos. Nuestros resultados muestran la relevancia del tipo y concentración de agente macromolecular usado para inducir LLPS, de manera que concentraciones mayores de agente macromolecular favorecen LLPS de αS a concentraciones menores de proteína. Utilizando Alexa Fluor como sonda en una batería de variantes de αS con diferentes regiones de la proteína eliminadas, nuestros resultados sugieren un papel esencial del dominio C-terminal en la LLPS, probablemente por interacciones con el dominio N-terminal, en contra de lo sugerido en publicaciones anteriores. Por el contrario, el dominio central NAC, dispensable para la LLPS, posee una gran implicación en la LSPT de condensados de αS formados en las condiciones de estudio. Los resultados presentados no pueden establecer una relación directa entre la LSPT de los condensados de αS y la agregación amiloide, aunque varias evidencias experimentales, entre ellas el papel del dominio NAC en esta transición, sugieren que es posible que se produzcan procesos de agregación amiloide en el interior de los condensados de αS.<br /

Caracterización de los factores y primeros eventos de malplegamiento en la agregación amiloide de α-sinucleína.

La α-sinucleína es una proteína muy estudiada por su implicación en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson. La agregación amiloide de esta proteína está relacionada con la toxicidad neuronal que conlleva la aparición de estas enfermedades, pero, pese a los estudios sobre el tema, todavía se desconocen los factores y los mecanismos que median su agregación. Parte de este desconocimiento se debe a la falta de condiciones experimentales in vitro que emulen lo que sucede in vivo. Parece ser que la agregación de α-sinucleína se favorece en el interior o la superficie de condensados celulares (los denominados orgánulos sin membrana) que se generan en las neuronas en condiciones de estrés. Este trabajo estudia, a modo preliminar, el comportamiento de α-sinucleína en diferentes microambientes resultado de un proceso de separación de fases líquido-líquido in vitro. Como primer paso para ello se caracterizó la formación y morfología de dos tipos de coacervados en función de la salinidad y la temperatura. Para ello se usaron técnicas de turbidimetría y microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC). A estos coacervados ya formados se les añadió α-sinucleína recombinante purificada, de la que parte era proteína marcada fluorescentemente a fin de evaluar por microscopía de fluorescencia el comportamiento de α-sinucleína. Se observó que la α-sinucleína parecía particionar preferentemente en coacervados artificiales in vitro con una carga neta ligeramente negativa. Este primer hallazgo abre la puerta a futuros estudios de agregación amiloide y cinéticas de agregación en modelos in vitro, más cercanos a las condiciones fisiológicas neuronales reales que los ensayos in vitro anteriores.<br /

Desarrollo de estrategias para la inhibición de la agregación amiloide de alfa-sinucleína y la estabilización de nuevos agregados intermedios como posibles biomarcadores para el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson

La α-sinucleína es una proteína intrínsecamente desordenada que puede plegarse de forma errónea y formar agregados amiloides, esto es, estructuras depositadas en el tejido neuronal de afectados por la enfermedad neurodegenerativa de Parkinson. Para que se formen estos agregados se debe dar el auto-ensamblaje de monómeros de proteína en forma, inicialmente de oligómeros y, finalmente, de fibras. El proceso se ha asociado a la inducción y progresión de neurodegeneración, con un papel muy relevante de las especies oligoméricas intermedias en la inducción de toxicidad. Actualmente, se están centrando todos los esfuerzos en encontrar biomarcadores para un diagnóstico precoz de Parkinson, ya que en la actualidad el diagnóstico es por una serie de características fenotípicas que aparecen cuando la enfermedad está ya muy avanzada y sólo se puede confirmar post-mortem. Por este motivo, en este trabajo abordamos el estudio cinético de una serie de compuestos previamente testados que pueden ser adecuados para inhibir la agregación de α-sinucleína y, de esta manera, atrapar algunas de las conformaciones oligoméricas con las que poder desarrollar biomarcadores específicos para un diagnóstico temprano de la enfermedad. Nuestros resultados indican que el compuesto flavonoide quercitina podría ser un candidato plausible para inhibir la agregación amiloide.<br /

Interacción entre alfa-sinucleina y tau en modelos celulares de la enfermedad de Parkinson

La enfermedad de Parkinson (PD) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más común después del Alzheimer y su característica anatómico-patológica principal son los cuerpos de Lewy compuestos mayoritariamente por alfa-sinucleína (aSyn), una proteína intrínsecamente desordenada que se encuentra en los terminales presinápticos del sistema nervioso central (SNC). Aunque se conoce que la enfermedad se extiende progresivamente desde el sistema nervioso entérico hasta el cerebro, todavía no se sabe cómo empieza a nivel molecular. Hoy en día se ha demostrado que también está implicada en la patología de PD la proteína tau y se ha verificado la interacción de la isoforma (4R/2N)N368 con la aSyn(N103) las cuales son producto de la actividad de la asparagina endopeptidasa (AEP) en condiciones fisiológicas. El presente trabajo se generan nuevos modelos celulares de PD basados, entre otros, en la interacción de estas dos proteínas, pero empleando la isoforma 4R/0N de tau para comprobar si también hay interacción con aSyn o con aSyn(N103). Para ello se generaron los vectores correspondientes para la sobreexpresión de las distintas isoformas fusionadas a proteínas fluorescentes. Los datos visualizados por microscopía no muestran cambios en la localización celular de aSyn frente a aSyn(N103), sin embargo, se manifiestan cambios en la localización celular de tau(4R/0N) frente a la localización de tau(4R/0N)N368 la cual parece perder la capacidad de unión a microtúbulos. Por otra parte, no se detecta colocalización ni interacción de dichas proteínas con los métodos empleados. Además, se indujo estrés oxidativo a cultivos celulares sobreexpresando dichas proteínas siendo los tratamientos con citrato amónico férrico, arsenito de sodio los que muestran un indicio de agregación de aSyn. No se detectaron diferencias en presencia o no de tau en el tratamiento de estrés oxidativo ni en la captación de aSyn exógena.<br /