Etude de la structure et du rôle du provirus dans la leucémogenèse par le virus de la leucémie bovine

Doctorat en Sciencesinfo:eu-repo/semantics/nonPublishe

Etude de la structure et du rôle du provirus dans la leucémogenèse par le virus de la leucémie bovine

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Etude in vitro et in vivo des mécanismes moléculaires d'activation lymphocitaire T et microgliale (identification de nouveaux marqueurs de sous-populations microgliales et de discrimination macrophagique)

La voie costimulatrice B7/CD28, indispensable à l'activation optimale des lymphocytes T (LT) et à la prévention de leur anergie, peut être manipulée pour augmenter ou diminuer les réponses immunitaires et ainsi concevoir des nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement respectif des cancers ou des maladies autoimmunes. L'obtention de tels traitements nécessite une meilleure compréhension des mécanismes de transduction associés à la molécule CD28, ainsi que leur relation avec le complexe TCR/CD3. Aussi, l'ADNc de la molécule CD28 humaine a été transfectée dans des thymomes murins exprimant ou non le complexe TCR/CD3 . La caractérisation des transfectants obtenus démontre que la production d'IL2 induite via CD28 nécessite l'expression du complexe TCR/TD3 mais que l'association de la PI3-kinase et la mobilisation calcique qui en découle est indépendante de ce complexe. Au sein du système nerveux central (SNC), les cellules microgliales (principales cellules immunocompétentes résidentes) sont des partenaires privilégiés des LT pour leurs actions effectrices. Dans le but de mieux caractériser leurs mécanismes moléculaires d'activation et de présentation antigénique, les messagers différentiellement exprimés dans 2 clones de cellules microgliales murines activées, potentialisant différemment l'activation lymphocytaire T auxiliaire et cytoxique, ont été isolés par hybridation soustractive (technique RDA). Seize messagers ont ainsi été obtenus dont 15 n'avaient jamais été décrits dans la microglie. Certaines de ces molécules semblent pouvoir servir de marqueurs d'activation et/ou de distinction de certaines ou de toutes les sous-populations microgliales. De plus, trois messagers permettent de discriminer les cellules microgliales des monocytes/macrophages in vitro, ainsi que de distinguer ces cellules dans le modèle animal de la Sclérose en Plaques, l'EAE.ANGERS-BU Lettres et Sciences (490072106) / SudocSudocFranceF

Synergie de l'immunothérapie et de la chimiothérapie pour l'induction de la présentation antigénique croisée par la microglie et le rejet tumoral dans un modèle pré-clinique de gliome murin

La présentation antigénique croisée permet de générer directement des lymphocytes T cytotoxiques, cellules les plus efficaces pour éliminer les cellules tumorales. Ce travail montre que les cellules microgliales adultes, principales cellules présentatrices d antigènes (CPA) du système nerveux central (SNC), et donc en première ligne face aux tumeurs cérébrales, sont capables in vivo de présenter de façon croisée des antigènes tumoraux issus de cellules tumorales mourantes traitées par un agent chimiothérapeutique (BCNU). Ainsi, la microglie constitue un appui pour l efficacité des réponses immunitaires anti-tumorales dans le cerveau. Cependant, pour une activation lymphocytaire optimale, cette aptitude est soumise à l injection d adjuvants destinés à contrer l immunosuppression locale du SNC. En parallèle, dans un modèle pré-clinique de gliome murin, le bénéfice de l association d une chimiothérapie administrée localement (BCNU) avec un protocole d immunothérapie a été étudié. La chimiothérapie permet l apoptose massive des cellules tumorales et donc la libération d antigènes. Le bras immunothérapeutique a pour but de lever une part de l immunosuppression tumorale par la déplétion des lymphocytes T régulateurs et à restimuler la réponse immunitaire via un agoniste du TLR9 capable de promouvoir l activation des CPA. L association de ces deux approches thérapeutiques permet ainsi à 93% des souris traitées de survivre ainsi que l induction d une réponse mémoire protégeant 43% d entre-elles d une seconde injection du gliome.Antigen cross-presentation induces cytotoxic T lymphocyte generation, the most efficient cells allowing tumor cell elimination. This work shows that adult microglial cells, the main antigen presenting cells (APC) of the central nervous system (CNS), in first line to brain tumors, are able to cross-present antigens from dying tumor cells treated by chemotherapy (BCNU) in vivo. Thus, microglia are necessary for anti-tumor immune response efficiency in the brain. Nevertheless, this ability is subjected to the injection of several adjuvants to counterbalance the local immunosuppression of the CNS and to obtain an optimal lymphocyte activation. Moreover, in a pre-clinical murine glioma model, we studied the benefit of the association of a local chemotherapy (BCNU) with an immunotherapeutic protocol. Chemotherapy enables a massive tumor apoptosis and therefore antigen release. The immunotherapeutic arm aims to remove a part of the tumor immunosuppression by the regulatory T lymphocyte depletion and to restimulate the immune response through a TLR9 agonist promoting APC activation. The combination of these two therapeutic approaches allows 93% of treated mice to survive and induces a memory immune response protecting 43% of them from tumor rechallenging.ANGERS-BU Médecine-Pharmacie (490072105) / SudocSudocFranceF

Caractérisation des cellules microgliales adultes et de leur potentiel en immunothérapie des tumeurs cérébrales

Les cellules microgliales, principales cellules immunocompétentes résidentes du système nerveux central (SNC), d'origine myéloïde, présentent un potentiel intéressant dans la lutte contre le cancer par leur localisation privilégiée dans les tumeurs cérébrales. A la moindre perturbation de leur microenvironnement, elles s'activent graduellement, ré-expriment toutes les molécules nécessaires à la présentation de l'antigène, perdent leurs prolongements cytoplasmiques jusqu'à devenir amiboïdes et sont donc à terme totalement indiscernables des macrophages périphériques. Dans le cadre d'une immunothérapie anti-tumorale, il est important pour mieux comprendre les réponses immunitaires de pouvoir distinguer les divers protagonistes. Au sein des produits d'une banque soustractive microgliale réalisée auparavant au laboratoire, trois ARNm se sont révélés discriminants entre cellules microgliales et macrophages primaires et ce, même en condition pro- ou anti-inflammatoire. Les cellules microgliales peuvent également dans certaines conditions se différencier en cellules type dendritique. Or ces dernières sont très prometteuses en immunothérapie active, notamment par leur capacité à effectuer la présentation croisée. En utilisant la microglie néonatale ou adulte primaire, nous avons mis en évidence que la microglie in vitro et ex vivo était aussi capable de présentation croisée et que celle-ci, bien que de faible intensité, peut être modulée positivement par le GM-CSF et le CpG. Deux modèles de tumeurs intracérébrales plus ou moins immunogènes implantées par stéréotaxie chez la souris ont alors été développés afin d'évaluer des protocoles utilisant ces résultats. Ainsi un traitement combinant déplétion des lymphocytes T régulateurs et injection de CpG permet de guérir la plupart des animaux ayant la tumeur la moins agressive mais ne montre en revanche pas de réel bénéfice pour la tumeur très agressive en intracérébral alors qu'en périphérie les résultats sont systématiquement meilleurs. Enfin, l'immune responsive gene 1, issu de la banque soustractive, a été caractérisé et s'avère être un nouveau marqueur potentiel d'activation des cellules immunitaires innées stimulées par les interférons ou les ligands des récepteurs Toll, aussi bien chez la souris que chez l'homme, et pourrait donc être intéressant pour suivre l'évolution de la réponse du système immunitaire après une thérapie.Microglial cells harbour an interesting potential against brain tumors. Following activation, they are indistinguishable from peripheral macrophages. Using products from a microglial subtractive bank obtained in the laboratory, we found that three messengers allowed to discriminate between primary microglia and macrophages. We also demonstrated that microglia was able in vitro and ex vivo to cross-present antigens and that this could be potentiated by CpG-ODN and GM-CSF. To take advantage of all these results, we developed two brain tumor models with different immunogenicity. A therapy combining regulatory T cell depletion and CpG-ODN injection was then evaluated against brain or peripheral tumors. To finish, we also characterized mouse and human IRG-1, that proved to be a new activation marker of innate immune cells stimulated by interferons or TLR agonists, and as such could be very useful at least to follow evolution of the immune response after application of a therapy.ANGERS-BU Médecine-Pharmacie (490072105) / SudocSudocFranceF

Chromosome integration domain for bovine leukemia provirus in tumors

The 3'-end host-virus junction fragments from two bovine leukemia virus (BLV)-induced lymphoid tumors (tumors 15-4 and 1351), each containing a single provirus, were used as probes to detect large restriction fragments flanking these proviruses. The DNAs from 28 other independent BLV-induced tumors were checked by Southern analysis of their restriction fragments for possible rearrangement due to the insertion of a BLV provirus in the cellular sequences corresponding to those flanking the proviruses in tumors 15-4 and 1351. In no case did proviral integration occur in cellular sequences corresponding to those implicated in the tumors of origin. According to the statistical analysis performed, if a preferential domain for BLV integration exists, it has a size of 1,304 kilobases when the probability of not observing an integration event in the cellular fragments considered in tumors 15-4 and 1351 is 0.50.SCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Nucleotide sequence analysis of the long terminal repeat of integrated bovine leukemia provirus DNA and of adjacent viral and host sequences

The nucleotide sequence of the 3' long terminal repeat and adjacent viral and host sequences was determined for a bovine leukemia provirus cloned from a bovine tumor. The long terminal repeat was found to comprise 535 nucleotides and to harbor at both ends an imperfect inverted repeat of 7 bases. Promoter-like sequences (Hogness box and CAT box), an mRNA capping site, and a core enhancer-related sequence were tentatively located. No kinship was detected between this bovine leukemia proviral fragment and other retroviral long terminal repeats, including that of human T-cell leukemia virus.SCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe

Interelationship between CD3 and CD28 pathways in a murine T cell thymoma

International audienceIt is well known that the CD28 costimulatory signal is important to complement T cell receptor (TCR)/CD3-initiated T cell activation, but the mechanism by which these two distinct signaling pathways are integrated is not clearly understood. In our laboratory, we dispose of a murine T cell hybridoma transfected with human CD28 molecule which is able to produce IL-2 in response to stimulation, suggesting that the signal transduction machinery coupled to the CD28 molecule is capable of triggering effector functions. Nevertheless, the action of three immunosuppressive agents previously shown in our model, suggested an interaction between the CD3 and CD28 pathways. We confirmed here this hypothesis by transfecting the cDNA of the human CD28 molecule in the BW5147 thymoma which lacks CD3 surface expression. Stimulation of the human CD28 did not lead to IL-2 secretion while the restoration of the TCR/CD3 complex re-established the functionality of this costimulatory molecule. These data demonstrate that the IL-2 production induced by the CD28 activation pathway is dependent of the TCR/CD3 complex cell surface expression and suggest the formation of a functional membrane complex between the CD3 and CD28 molecules. The molecular basis of the functional dependence of CD28 signaling on the TCR/CD3 complex is presently unknown. Nonetheless, we showed that some early events induced by CD28 stimulation, such as PI3-kinase association, are independent of the TCR/CD3 complex expression

The interferon- and virus-inducible IFI-56K and IFI-54K genes are located on human chromosome 10 at bands q23-q24

IFI-56K and IFI-54K are two human genes that are strongly induced by interferon and viruses. These genes are closely related at the protein, RNA, and promoter levels. By means of the somatic cell hybrid technique, the two genes have been previously located on chromosome 10. Using in situ hybridization, we show here that both IFI-54K and IFI-56K genes map to 10q23-q34. This result does not confirm the previous localization of the IFI-56K gene at the junction of the 10q25 and 10q26 bands. © 1992.SCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe