Espressione dei geni GUS e UGT85A in Arabidopsis thaliana

Le \u3b2-glucuronidasi (GUS) sono enzimi che catalizzano l\u2019idrolisi del legame glicosidico fra l\u2019acido \u3b2-glucuronico e altre molecole e sono suddivise in due famiglie: glicosil-idrolasi 2 e glicosil-idrolasi 79. Le \u3b2-glucuronidasi della famiglia 2, alle quali appartiene il GUS di E. coli largamente usato come gene reporter nei vegetali, sono note in un grande range di organismi, ma sembrano essere assenti nelle piante, nelle quali l\u2019attivit\ue0 GUS endogena sembra associata a \u3b2-glucuronidasi della famiglia 79 (Eparanasi) (1). In Arabidpopsis thaliana sono stati identificati e parzialmente caratterizzati tre diversi geni GUS (AtGUS1, AtGUS2 e AtGUS3), dei quali AtGUS1 e AtGUS2 mostrano elevata omologia. A parte funzioni specifiche (2),coinvolgimento delle \u3b2-glucuronidasi \ue8 stato proposto nel processo di accrescimento cellulare per distensione e, in particolare, nell\u2019allungamento dei peli radicali (3). E\u2019 stato, inoltre, ipotizzato che \u3b2-glucuronidasi, agendo in coordinazione con glucuronisiltrasferasi (UGT) del gruppo 85A, siano responsabili della regolazione del ciclo cellulare (4,5). Uno studio pi\uf9 recente tuttavia ha messo in parte in discussione quanto emerso in precedenza riportando che nelle radici di plantule di Arabidopsis thaliana non \ue8 presente attivit\ue0 \u3b2-glucuronidasica (6). In questo lavoro si \ue8 voluto approfondire lo studio dell\u2019espressione dei geni GUS e UGT in Arabidopsis. Verifiche preliminari effettuate con PCR semiquantitativa hanno mostrato che, nonostante il gene AtGUS2 risulti espresso in modo pi\uf9 rilevante rispetto a AtGUS1 e AtGUS3, tutti e tre i geni AtGUS sono espressi, sia pure differenzialmente, in tutti gli organi della pianta. I geni AtUGT85A mostranoun pattern di espressione pi\uf9 differenziato rispetto ai geni AtGUS. AtUGT85A1, AtUGT85A2 e AtUGT85A4 risultano differenzialmente espressi nei vari organi della pianta, mentre AtUGT85A3 e UGT85A7 mostrano un\u2019espressione organo specifica che coinvolge fiore e foglia Utilizzando la tecnica di ibridazione in situ con sonde multiple recentemente messa a punto su campioni vegetali (7), l\u2019espressione dei geni GUS \ue8 stata studiata anche a livello tissutale. A livello radicale , il pattern di espressione dei tre geni analizzati appare chiaramente differenziato: AtGUS1 e AtGUS2 sono espressi nell\u2019epidermide, nella zona corticale e nella cuffia, mentre l\u2019espressione di AtGUS3 \ue8 limitata all\u2019epidermide. Sono in corso le analisi relative agli altri organi della pianta e, in particolare, fiore e polline. Analogo approccio verr\ue0 esteso ai geni AtUGT85 al fine di verificarne l\u2019overlapping o meno con i domini istologici di espressione dei geni GUS e definirne eventuali correlazioni

Analysis of AtGUS1 and AtGUS2 in Arabidopsis root apex by a highly sensitive TSA-MISH method

A new highly sensitive whole-mount in situ hybridization method, based on tyramide signal amplification (TSA-MISH) was developed and a combined GFP detection and TSA-MISH procedure was applied for the first time in plants, to precisely define the spatial pattern of AtGUS1 and AtGUS2 expression in the root apex. \u3b2-glucuronidases (GUSs) belonging to the glycosyl hydrolases (GHs) 79 family, are widely distributed in plants, but their functional role has not yet been fully investigated. In the model system Arabidopsis Thaliana, three different AtGUS genes have been identified which encode proteins with putative different fates. Endogenous GUS expression has been detected in different organs and tissues, but the cyto-histological domains of gene expression remain unclear. The results here reported show co-expression of AtGUS1 and AtGUS2 in different functional zones of the root apex (the cap central zone, the root cap meristem, the staminal cell niche and the cortical cell layers of the proximal meristem), while AtGUS2 is exclusively expressed in the cap peripheral layer and in the epidermis in the elongation zone. Interestingly, both genes are not expressed in the stelar portion of the proximal meristem. A spatial (cortex vs. stele) and temporal (proximal meristem vs. transition zone) regulation of AtGUS1 and AtGUS2 expression is therefore active in the root apex. This expression pattern, although globally consistent with the involvement of GUS activity in both cell proliferation and elongation, clearly indicates that AtGUS1 and AtGUS2 could control distinct downstream process depending on the developmental context and the interaction with other players of root growth control. In the future, the newly developed approaches may well be very useful to dissect such interactions