Evaluación de la genotoxocidad de un compuesto del extracto de proallium ap® mediante el ensayo cometa con potencial uso en el envase alimentario.

Con el fin de reducir el uso de conservantes sintéticos, la industria alimentaria ha comenzado a desarrollar nuevos sistemas de envasado incorporando al embalaje aceites esenciales (AEs) que, por sus propiedades antimicrobianas y antioxidantes, contribuyan a aumentar la vida útil y calidad de los alimentos perecederos. Aunque el uso de estos AEs en el envasado de los alimentos no está permitido aún en Europa actualmente, los estudios que evalúan la seguridad de sus principales componentes son de gran interés. El presente trabajo tiene como objetivo evaluar por primera vez el potencial genotóxico de Propil Propano Tiosulfinato (PTS), uno de los componentes del Proallium AP®, un extracto comercial basado en los AEs del ajo (Allium sativum) y la cebolla (Allium cepa) destinado a ser utilizado en el envasado activo. Para ello, se estudió el daño genotóxico y la oxidación del ADN en la línea celular intestinal humana Caco-2. Las células fueron expuestas a diferentes concentraciones de PTS (70, 140 y 280 μM) durante 24 y 48 h. Se evaluó el daño genotóxico directo mediante el empleo del ensayo cometa estándar y la oxidación del ADN mediante el empleo de las enzimas endonucleasa III (Endo III) y formamidopirimidina ADN glicosilasa (FPG) a través del ensayo cometa modificado. Los resultados demostraron que el PTS provoca cierto daño genotóxico a 280 μM. Sin embargo, a las concentraciones de interés para el envasado activo, el PTS no provocó rotura directa de la hebra de ADN. Por otra parte, los valores obtenidos tras la incubación con enzimas de restricción, no muestran oxidación de las bases nitrogenadas del ADN. A pesar de que se requieren más ensayos con el fin de determinar el perfil toxicológico del PTS, este compuesto organosulfurado se presenta actualmente como una buena alternativa natural a otros aditivos sintéticos utilizados en la industria alimentariaUniversidad de Sevilla. Grado en Farmaci

In Vitro Toxicity Assessment of Stilbene Extract for Its Potential Use as Antioxidant in the Wine Industry

The reduction of sulfur dioxide in wine is a consumer’s demand, considering the allergic effects that may occur in people who are sensitive to it. Stilbenes are candidates of great interest for this purpose because of their antioxidant/antimicrobial activities and health properties, and also because they are naturally found in the grapevine. In the present study, the in vitro toxicity of an extract from grapevine shoots (with a stilbene richness of 45.4%) was assessed in two human cell lines. Significant damage was observed from 30 μg/mL after 24 h, and 40 µg/mL after 48 h of exposure. Similarly, the ultrastructural study revealed a significant impairment of cell growing. The extract was able to protect cells against an induced oxidative stress at all concentrations studied. In view of the promising results, a more exhaustive toxicological assessment of the extract is needed to confirm the safety of its further use as additive in wine.España,Ministerio de Economía, Industria y Competitividad and INIA for the financial support for this project (RTA2015-00005-C02-02

Genotoxicity evaluation of graphene derivatives by a battery of in vitro assays

The interest of graphene materials has increased markedly in the recent years for their promising applications in many fields as food packing. These new applications have caused some concern regarding their safety for consumers since the intake of these materials may increase. In this sense, a battery of in vitro test is required before its use as a food contact material. Then, the aim of this study was to assess the potential mutagenicity and genotoxicity of graphene oxide (GO) and reduced-graphene oxide (rGO) following the recommendations of the European Food Safety Authority (EFSA). Thus, the mouse lymphoma assay (MLA) and the micronucleus test (MN) were performed in L5178YTk ± cells, and the Caco-2 cells were used for the standard and modified comet assays. The results indicated that GO (0–250 μg/mL) was not mutagenic in the MLA. However, rGO revealed mutagenic activity from 250 μg/mL and 125 μg/mL after 4h and 24h of exposure, respectively. In the MN test, negative results were obtained for both compounds at the concentrations assayed (0–250 μg/mL) for GO/rGO. Moreover, no DNA strand breaks, or oxidative DNA damage were detected in Caco-2 cells exposed to GO (0–250 μg/mL) and rGO (0–176.3 μg/mL for 24h and 0–166.5 μg/mL for 48h). Considering the mutagenic potential of rGO observed further investigation is needed to describe its toxic profile

In Vivo Genotoxicity Evaluation of a Stilbene Extract Prior to Its Use as a Natural Additive: A Combination of the Micronucleus Test and the Comet Assay

Genotoxic data of substances that could be used as food additives are required by the European Food Safety Authority. In this sense, the use of an extract from grapevine shoots containing a stilbene richness of 99% (ST-99), due to its antioxidant and antibacterial activities, has been proposed as an alternative to sulfur dioxide in wine. The aim of this work was to study, for the first time, the in vivo genotoxic effects produced in rats orally exposed to 90, 180, or 360 mg ST-99/kg body weight at 0, 24, and 45 h. The combination of micronucleus assay in bone marrow (OECD 474) and standard (OECD 489) and enzyme-modified comet assay was used to determine the genotoxicity on cells isolated from stomach, liver, and blood of exposed animals. The ST-99 revealed no in vivo genotoxicity. These results were corroborated by analytical studies that confirm the presence of stilbenes and their metabolites in plasma and tissues. Moreover, to complete these findings, a histopathological study was performed under light microscopy in liver and stomach showing only slight modifications in both organs at the highest concentration used. The present work confirms that this extract is not genotoxic presenting a good profile for its potential application as a preservative in the wine industry.España Ministerio de Economía, Industria y Competitividad and INIA RTA2015-00005-C02-0

Cytotoxicity studies of a stilbene extract and its main components intended to be used as preservative in the wine industry

The use of stilbenes has been proposed as an alternative to sulfur dioxide in wine. Provided the feasibility from a technological approach, the cytotoxicity of an extract from grapevine shoots containing a stilbene richness of 99% (ST-99 extract) was assessed in the human cell lines HepG2 and Caco-2. In addition, the effects of the main stilbenes found in ST-99, trans-resveratrol and trans-ε-viniferin were studied, as well as its mixture. Similar cytotoxic effects were obtained in the exposures to trans-ε-viniferin, ST-99 and the mixture; however, trans-resveratrol alone exerted less toxicity. When HepG2 cells were exposed to trans-ε-viniferin, ST-99 and the mixture, the mean effective concentration (EC50) were 28.28 ± 2.15, 31.91 ± 1.55 and 29.47 ± 3.54 µg/mL, respectively. However, in the exposure to trans-resveratrol, the EC50 was higher 50 µg/mL. The morphological study evidenced damage at ultrastructural level in HepG2 cells, highlighting the inhibition of cell proliferation and the induction of apoptosis. The type of interaction produced by trans-ε-viniferin and trans-resveratrol mixtures was assessed by an isobologram analysis using the CalcuSyn software, evidencing an antagonist effect. These data comprise a starting point in the toxicological assessment; further studies are needed in this field to assure the safety of the extract ST-99.Ministerio de Economía, Industria y Competitividad and INIA (RTA2015-00005-C02-02)Bordeaux Metabolome Facility and MetaboHUB (ANR-11-INBS-0010 project

Genotoxicity Evaluation of Two Derived Products from Allium Extracts: s-propylmercaptocysteine and s-propyl Mercaptoglutathione

Propyl-propane-thiosulfonate (PTSO) is one of the main organosulfur compounds present in Allium essential oils with a widely documented biological activity. For this reason, it could be used as a food and feed additive in the agri-food industry. A genotoxicity evaluation of substances and their metabolites present in food is necessary to guarantee the consumer's health following the recommendations of the European Food Safety Authority (EFSA). To evaluate the toxicological profile of derivatives of PTSO, the cytotoxicity, an Ames test, a micronucleus test and the comet assay were performed. Results showed that non-cytotoxic effects were observed in Caco-2 exposed to s-propyl mercaptocysteine (CSSP) and s-propyl mercaptoglutathione (GSSP) (0–450 μM). The mutagenicity index remained in the range of 0.6–1.4 for both compounds, showing no mutagenic effects for the concentrations of 5000–312.5 μg GSSP/plate and 250–15.63 μg CSSP/plate. Moreover, the % binucleated cells with micronuclei were 1.3–2.2 and 1.6–2.7 for GSSP and GSSP, respectively. For comet assays there was no DNA-genotoxic or oxidative damage in a concentration range of 112.5–450 μM. Therefore, we can conclude that these compounds are not genotoxic at the conditions tested. These results support that the presence of CSSP and GSSP in the food/feed is not of concern, although further studies are needed to complete their safety profile.Junta de Andalucía AT17_5323_USE, P18-TP-2147Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades FPU2019-0124

Cylindrospermopsin-microcystin-LR combinations may induce genotoxic and histopathological damage in rats

Cylindrospermopsin (CYN) and microcystins (MC) are cyanotoxins that can occur simultaneously in contaminated water and food. CYN/MC-LR mixtures previously investigated in vitro showed an induction of micronucleus (MN) formation only in the presence of the metabolic fraction S9. When this is the case, the European Food Safety Authority recommends a follow up to in vivo testing. Thus, rats were orally exposed to 7.5 + 75, 23.7 + 237, and 75 + 750 μg CYN/MC-LR/kg body weight (b.w.). The MN test in bone marrow was performed, and the standard and modified comet assays were carried out to measure DNA strand breaks or oxidative DNA damage in stomach, liver, and blood cells. The results revealed an increase in MN formation in bone marrow, at all the assayed doses. However, no DNA strand breaks nor oxidative DNA damage were induced, as shown in the comet assays. The histopathological study indicated alterations only in the highest dose group. Liver was the target organ showing fatty degeneration and necrotic hepatocytes in centrilobular areas, as well as a light mononuclear inflammatory periportal infiltrate. Additionally, the stomach had flaking epithelium and mild necrosis of epithelial cells. Therefore, the combined exposure to cyanotoxins may induce genotoxic and histopathological damage in vivo.Ministerio de Economía y Competitividad AGL2015-64558-

Estilbenos como una alternativa sostenible al anhídrido sulfuroso en vinos

Resumen El anhídrido sulfuroso (SO2) es el conservante más empleado en la industria agroalimentaria y enológica por sus propiedades antioxidantes y antimicrobianas. Sin embargo, también es un alérgeno que puede provocar problemas de salud en personas sensibles a él. Por otra parte, la madera de poda procedente de los viñedos es uno de los principales subproductos de la industria vitivinícola, con un volumen estimado entre 2 y 4 toneladas por hectárea y año. Este subproducto vitícola contiene polifenoles, entre otros estilbenos bioactivos con propiedades saludables. En el presente trabajo se ha elaborado y caracterizado un extracto puro de estilbenos obtenido a partir de madera de poda de la vid, para utilizarlo como alternativa sostenible al SO2 en la elaboración de vinos blancos y rosados. Se evaluó el impacto del extracto sobre la calidad de los vinos (parámetros enológicos, color, compuestos fenólicos y perfil sensorial) tanto en el embotellado y a los doce meses del embotellado. En paralelo se evaluó la posible toxicidad del extracto. Los resultados obtenidos concluyen que el extracto puro de estilbenos, obtenido a partir de madera de poda de la vid, puede proponerse como alternativa natural y sostenible al empleo de SO2 en la vinificación de vinos blancos y rosados. Además, el extracto no mostró toxicidad ni in vitro ni in vivo

Scientific Dissemination Conference: Contributions of Toxicology in Substance Safety Research and for Society

Las “Jornadas de divulgación científica: Aportaciones de la Toxicología en la investigación de la seguridad de las sustancias y para la sociedad” se celebraron el 19 de mayo de 2023 en la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, gracias a una Ayuda recibida por el VII Plan Propio de la Universidad de Sevilla (VII PPIT-US) para actividades de divulgación científica. El objetivo fue divulgar entre nuestros alumnos los conocimientos científicos por parte de personal docente e investigador altamente cualificado, y también dar a conocer a la sociedad en general el trabajo de investigación científica de alto nivel que se está realizando en la US. La actividad iba dirigida a los alumnos de las asignaturas de “Toxicología”, “Quimioinformática, Investigación e Historia de la Farmacia”, “Laboratorio de Farmacia” (del Grado en Farmacia, Grado en Óptica y Optometría, y Doble Grado en Farmacia y Óptica y Optometría), y las asignaturas de “Toxicología de las Drogas de Abuso” o “Introducción a las Ciencias Forenses” (Grado en Criminología). Durante las Jornadas, que duraron 5,5 horas, se impartieron un total de 6 comunicaciones orales con diferente temática: el grafeno, las cianotoxinas, los aditivos aliáceos en alimentación humana y animal, los estilbenos en los vinos, o los bioplaguicidas; todas ellas sintetizadas en unos trípticos divulgativos repartidos entre los asistentes para su divulgación en su entorno social. Asimismo, se realizaron 2 ponencias invitadas por parte de expertos en Toxicología Forense y Ambiental, respectivamente. La actividad contó con casi un total de 75 asistentes y los resultados de las encuestas mostraron en general un alto grado de satisfacción con las mismas, mostrando las Jornadas como una enriquecedora actividad de divulgación científica, por la variedad de temas tratados, los nuevos conocimientos adquiridos y el acercamiento a la investigación e interés suscitado entre los asistentes.The " Scientific dissemination conference: Contributions of Toxicology in substance safety research and for society" were held on May 19th, 2023 at the Faculty of Pharmacy of the University of Seville, thanks to a financial support received by the VII Plan Propio of the University of Seville (VII PPIT-US) for scientific dissemination activities. The objective was to disseminate scientific knowledge among our students by highly qualified teaching and scientific personnel, and also to inform society in general of the high-level scientific research work that is being carried out in the University of Seville. The activity was aimed at students of the subjects of "Toxicology", "Chemoinformatics, Research and History of Pharmacy", " Laboratory of Pharmacy" (of the Degree in Pharmacy, Degree in Optics and Optometry, and Double Degree in Pharmacy and Optics and Optometry), and the subjects of "Toxicology of the Drugs of Abuse" or "Introduction to Forensic Sciences" (Degree in Criminology). During the Conference, which lasted 5.5 hours, 6 oral communications were given on graphene, cyanotoxins, alliaceous additives in human and animal feed, stilbenes in wines, or biopesticides. All of them were synthesized in informative triptychs distributed among the attendees for their dissemination in their social environment. Likewise, 2 invited presentations were given by experts in Forensic and Environmental Toxicology, respectively. The activity had 75 attendees and the results of the surveys generally showed a high degree of satisfaction with them, showing the Conference as an enriching outreach activity, due to the variety of topics covered, the new knowledge acquired and the approach to research and interest aroused among attendees

Estilbenos como una alternativa sostenible al anhídrido sulfuroso en vinos. Evaluación de la toxicidad del extracto de estilbeno

La demanda de los consumidores por alimentos cada vez más naturales está creando una tendencia creciente en la industria alimentaria hacia el empleo de ingredientes y aditivos naturales como alternativa a los conservantes químicos. En este sentido, la búsqueda de alternativas al uso del dióxido de azufre (SO2) en la industria del vino es un campo en auge. Una de las estrategias que se ha encontrado para cubrir esta necesidad ha sido el uso de estilbenos debido a sus interesantes propiedades antimicrobianas y antioxidantes. Además, estos compuestos se encuentran de forma natural en los sarmientos de la vid, subproductos de la industria vitinícola con valor añadido nulo actualmente. La posibilidad de incrementar el valor añadido de los subproductos que se producen en las bodegas es de gran interés, ya que se estima que se generan entre 2 y 4 toneladas por hectárea de viñedo y año, según datos recientes de la Organización Mundial de la Viña y el Vino (OIV). El empleo de estas sustancias en la industria alimentaria debe ser seguro para los consumidores. En este sentido, hemos revisado la bibliografía existente relacionada con estudios de toxicidad in vitro e in vivo de tres estilbenos: piceatanol, pterostilbeno y ε-viniferina. Estos compuestos fueron escogidos debido a que se encuentran de manera abundante en la naturaleza y poseen propiedades biológicas interesantes para su uso en alimentos. Sin embargo, hasta el momento, la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) no ha publicado ninguna evaluación de estos compuestos para garantizar su seguridad como aditivos. En esta revisión, se puso de manifiesto que estos estilbenos presentan una importante citotoxicidad en líneas celulares cancerígenas y no cancerígenas. Además, el daño en el ADN inducido por estos compuestos se ha demostrado por varios métodos como un posible mecanismo de citotoxicidad. Sin embargo, el potencial genotóxico in vitro del piceatanol, pterostilbeno y la -viniferina se ha estudiado poco y no se han realizado estudios siguiendo las directrices de la EFSA. En cuanto a los efectos in vivo, no existen estudios que valoren el potencial genotóxico en modelos in vivo ya que la mayoría de los autores se han centrado en sus propiedades beneficiosas. Por lo tanto, para garantizar la seguridad del uso de piceatannol, pterostilbeno y ε-viniferina, se necesitan más estudios de acuerdo con las recomendaciones de la EFSA que evalúen los efectos genotoxicos in vitro e in vivo. Esta revisión ha dado lugar a la siguiente publicación: • TOXICOLOGICAL EVALUATION OF PICEATANNOL, PTEROSTILBENE AND ε-VINIFERIN FOR THEIR POTENTIAL USE IN THE FOOD INDUSTRY: A REVIEW (Medrano-Padial et al., 2021. Food Control (en revision). La presente tesis doctoral se engloba dentro de un proyecto coordinado con el grupo del Instituto de Formación e Investigación Agraria y Pesquera (IFAPA) de la Dra. Emma Cantos-Villar, quienes obtuvieron y caracterizaron dos extractos procedentes de subproductos de la industria vitivinícola, con una riqueza de 45.4% y 99% en estilbenos, con el fin de utilizaros como sustitutos totales o parciales del SO2 en el vino. Para garantizar la seguridad de estos extractos se llevaron a cabo los ensayos recomendados por la EFSA, siendo el primer paso la realización de distintos ensayos in vitro. Además, también se estudiaron sus estilbenos mayoritarios (trans-ε-viniferina y trans-resveratrol) y su mezcla en la misma proporción que en el extracto de mayor riqueza (1:3.9) para comprender sus mecanismos de acción en más profundad. Esta evaluación se realizó teniendo en cuenta que la vía oral será la preferente para estos extractos puesto que la exposición ocurrirá a través del vino. Así pues, se escogieron dos líneas celulares del aparato digestivo: las células de hepatocarcinoma humano HepG2, ya que el hígado es el principal órgano de biotransformación, y las células de adenocarcinoma de colon humano Caco-2, por ser el intestino el órgano que se ocupa de la absorción y donde existe mayor tiempo de contacto con las sustancias ingeridas. En primer lugar, el estudio de los efectos de ambos extractos, sus compuestos mayoritarios y su mezcla se llevó a cabo mediante ensayos de citotoxicidad y análisis de la morfología celular. Los ensayos de citotoxicidad se realizaron evaluando la afectación de tres biomarcadores (ensayo de la sal de tetrazolio (3- [4,5, dimetiltiazol-2-il]-5-[3-carboximetoxi-fenil]-2-[4-sulfofenil]-2H-tetrazolio) (MTS), ensayo del rojo neutro (RN) y contenido proteico (PT)) y nos permitieron conocer la concentración efectiva media (EC50) tras 24 y 48 h de exposición. Además, los efectos ultraestructurales causados en las células por estos compuestos se evaluaron observando su morfología. Los resultados obtenidos indicaron que ambos extractos y la mezcla de sus compuestos mayoritarios poseen una citotoxicidad parecida en ambas líneas celulares dando lugar a vacuolas de lípidos, núcleos apoptóticos y aberraciones mitóticas. Sin embargo, la trans-ε-viniferina produjo la muerte celular de manera más potente y a concentraciones más bajas que los demás compuestos ensayados. Por último, el trans-resveratrol tan sólo produjo una leve citotoxicidad tras 48 h de exposición. Por otro lado, una vez analizada la citotoxicidad y los cambios morfológicos producidos por estos compuestos, realizamos un estudio de isobologramas con el fin de conocer el tipo de interacción entre la trans-ε-viniferina y el trans-resveratrol. Según la bibliografía disponible, es la primera vez que se ha usado este ensayo para estudiar la interacción entre estos dos compuestos. Los resultados indicaron que estos compuestos presentan un efecto antagónico. Por otra parte, debido a que los estilbenos poseen una gran actividad antioxidante, se realizó un estudio del estrés oxidativo de las células HepG2 y Caco-2 tras la exposición de estos compuestos, ya que las sustancias antioxidantes pueden tener un carácter prooxidante dependiendo de la línea celular estudiada, concentración y condiciones de exposición. Para ello, evaluamos el contenido en especies reactivas de oxígeno (ERO) y el contenido en glutation (GSH) de ambas líneas celulares expuestas a ambos extractos, trans-ε-viniferina, trans-resveratrol y su mezcla. Además, para completar estos resultados, se estudió la capacidad de estos compuestos tanto para proteger como para revertir el daño producido por un agente oxidante. Los datos obtenidos en estos ensayos indican que ambos extractos, la trans-ε-viniferina y su mezcla con trans-resveratrol poseen interesante actividad antioxidante, mientras que el trans-resveratrol de manera individual no fue capaz de modular el estrés oxidativo en estas células. Esta batería de ensayos in vitro dio lugar a las siguientes publicaciones: • IN VITRO TOXICITY ASSESSMENT OF STILBENE EXTRACT FOR ITS POTENTIAL USE AS ANTIOXIDANT IN THE WINE INDUSTRY (Medrano-Padial et al., 2019; Antioxidants, 8, 467). RESUMEN TESEO • CYTOTOXICITY STUDIES OF A STILBENE EXTRACT AND ITS MAIN COMPONENTS INTENDED TO BE USED AS PRESERVATIVE IN THE WINE INDUSTRY (Medrano-Padial et al., 2020; Food Research International, 137, 109738). • PROTECTION AND REVERSION ROLE OF A PURE STILBENE EXTRACT FROM GRAPEVINE SHOOT AND ITS MAJOR COMPOUNDS AGAINST AN INDUCED OXIDATIVE STRESS (Medrano-Padial et al., 2020; Journal of Functional Foods (en revision). A continuación, siguiendo las recomendaciones de la EFSA para la evaluación de sustancias para su posible uso como aditivos, el siguiente paso es la realización de ensayos de mutagenicidad y genotoxicidad. Para ello, decidimos escoger el extracto con mayor riqueza en estilbenos (ST-99) ya que presentó el mejor perfil toxicológico y tecnológico. Además, se demostró que el uso de este extracto no modificó las propiedades sensoriales ni alteró la calidad del vino tinto. Los ensayos recomendamos por la EFSA son dos: el test de Ames y el ensayo de micronúcleos (MN). En el test de Ames evaluamos el potencial mutagénico del extracto en cinco cepas de Salmonella typhimurium en concentraciones desde 48 a 5000 μg/placa. En este ensayo, no se observaron diferencias significativas a ninguna de las concentraciones ensayadas, en presencia o en ausencia de la fracción microsómica S9. Por otro lado, el ensayo de MN en células L5178Y TK+/- nos permitió conocer el potencial de este extracto para producir MN que contengan fragmentos o cromosomas enteros. Los resultados indicaron que en ausencia de S9 ninguna de las concentraciones del extracto ST-99 ensayadas (4-64 μg/mL) produjo un aumento en la frecuencia de células binucleadas con MN (CBMN). Sin embargo, sí se observó un aumento de CBMN en presencia de S9 después de la exposición a la concentración más alta estudiada (3.45-60 μg/mL). Para completar esta evaluación, decidimos realizar el ensayo cometa estándar y modificado con la enzima formamidopirimidina glicosilasa (FPG). Esta técnica nos permitió conocer que el extracto ST-99 no produce rotura directa de la hebra de ADN ni oxidación de las bases purinas. Además, evaluamos la capacidad del extracto para proteger y revertir el daño oxidativo producido en el ADN por H2O2 y Ro19-8022. Los resultados indican que este efecto fue contrarrestado a las concentraciones más altas ensayadas en las células HepG2 y Caco-2 (EC50). Los datos obtenidos en estos tres ensayados fueron incluidos en el siguiente trabajo: • MUTAGENIC AND GENOTOXIC POTENTIAL ASSESSMENT OF A PURE STILBENE EXTRACT BY IN VITRO STUDIES (Medrano-Padial et al., 2021. Food and Chemical toxicology (en revision). Posteriormente, teniendo en cuenta los resultados contradictorios de genotoxicidad del extracto ST-99 in vitro, siguiendo las recomendaciones de la EFSA, se procedió al estudio del potencial genotóxico in vivo del extracto. Para ello, realizamos un estudio combinando el ensayo de MN en médula ósea y el ensayo cometa en hígado, estómago y sangre, tanto estándar como modificado con las enzimas FPG y Endonucleasa III (Endo-III). Los resultados obtenidos indican que el extracto no causa rotura ni oxidación en el ADN en ninguno de los tejidos estudiados. Por otro lado, en el ensayo de MN, tanto la relación entre eritrocritos policromáticos y normocromáitcos como el número de MN en eritrocitos policromáticos fueron similares en las ratas control y las tratadas, indicando que nuestro extracto no produce daño a nivel de médula ósea. Además, para completar estos resultados, se realizó un estudio histopatológico de la afectación del hígado y estómago, indicándose que tan sólo a la concentración más alta ensayada, la cual es 100 veces superior a la dosis que llegaría al consumidor (360 μg/mL), se detectaron leves daños. Además, según las recomendaciones de la OCDE, la ausencia de toxicidad debe ser corroborada con algún método que confirme que los tejidos diana han sido expuestos a la sustancia de estudio (OCDE 474 y OCDE 489). Por ello, llevamos a cabo una cromatografía líquida de ultra alta presión acoplada a un espectrómetro de masas (UPLC-HESI-MS) como técnica para demostrar presencia de los estilbenos y sus derivados en muestras biológicas. Los resultados indican que tanto la trans-ε-viniferina como el trans-resveratrol y sus derivados están presentes en sangre. Estos datos se recogen en la siguiente publicación: • IN VIVO GENOTOXICITY OF STILBENE EXTRACT INTENDED TO BE USED AS NATURAL ADDITIVE: A COMBINATION OF THE MICRONUCLEUS TEST AND THE COMET ASSAY (título provisional)