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Entwicklung und Anwendung von In-vitro- und In-vivo-Mikrodialysemethoden als Beitrag zu einer Biomarkerprofilerhebung und der Charakterisierung von Arzneistoffverteilungsprozessen
Cytokines as immunomodulatory proteins are secreted by immune and tissue cells
mediating immune responses, e.g. inflammation. The use of microdialysis as a
minimally invasive technique for sampling interstitial fluid might provide the
basis for biomarker profiling for diseases and therapy monitoring. The
objectives of this thesis were to develop reproducible bioanalytical methods
and apply them to define feasibility and applicability limits for the
quantification of cytokines in microdialysate. A commercially available, flow-
cytometry based cytokine assay for the four selected model cytokines
Interleukin-6 (pro-), Interleukin-8 (pro-), Interleukin-10 (anti-) and Tumour
Necrosis Factor-alpha (proinflammatory), which was previously adapted to
microdialysate as the respective matrix, was successfully validated for the
physiologically relevant concentration range of 5-10000 pg/mL. In vitro
microdialysis recovery and delivery investigations were performed utilising a
standardised system. System suitability was investigated exploring analyte
adsorption, pH effects, the influence of cytokine concentration and of
temperature of the catheter-surrounding medium on the relative recovery. A
mixture of Ringer’s solution and human albumin solution (0.5%) was used as
microperfusate and catheter-surrounding medium. Microdialysate was sampled
using linear catheters at flow rates of 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, and 5.0 µL/min.
All samples were measured using the validated flow-cytometry method adapted to
µDialysate. In vitro investigations confirmed the similarity of gain and loss
of only Interleukin-8 via the microdialysis membrane. Delivery investigation
of the remaining cytokines partly revealed implausible results, which led to
the conclusion that the method of retrodialysis for in vivo catheter
calibration of cytokines has to be excluded for clinical studies with
microdialysis. Consequently, the flow-rate-variation method was applied for
the calibration of the microdialysis catheters in the subsequent in vivo
investigation. Moreover, individual cytokine concentrations in microdialysate
were observed over a period of three days. The in vivo long-term microdialysis
setting was evaluated to be feasible for clinical studies. The study sampling
schedule was critically checked and assessed as requiring optimisation. An
alternative schedule was worked out and proposed for future clinical trials
investigating microdialysis of the four model cytokines. Furthermore, this
approach and investigation have in future to be extended to the population of
patients with diseases predominantly effecting special tissues. For example,
the potential of cytokine concentration measurement as a biomarker monitoring
in infected tissues should be evaluated. Another approach to increase
understanding of drug distribution processes by the application of
microdialysis to optimise drug therapy was acquired. In addition to the
systemic exposure, concentrations of the antifungal agent voriconazole were
monitored in the abdominal subcutaneous adipose tissue. In this clinical
study, voriconazole showed an extensive distribution to the investigated
target site. However, high variability was observed in drug distribution as
well as in the systemic and target-site drug accumulation for the nine healthy
volunteers. Genotyping of the polymorphic metabolic isoenzymes CYP2C9 and
CYP2C9 revealed data for the preliminary assessment of an effect on VRC
exposure. Especially for the polymorphism of CYP2C19, an essential influence
on the systemic as well as the peripheral drug clearance was indicated by the
current results. The further evaluation of microdialysis of cytokines as
biomarkers and the combination of both investigated approaches will
potentially contribute to the optimisation of currently applied
(antiinfective) drug therapies.Zytokine werden im Zuge der Immunantwort, z.B. im Rahmen einer Entzündung, als
mediatorische Proteine von Immun- sowie Gewebszellen sezerniert. Die
Mikrodialyse als minimal-invasive Technologie zur Gewinnung interstitieller
Flüssigkeit kann eine Grundlage für die Erstellung von Biomarkerprofilen für
Erkrankungen und deren Therapieüberwachung bilden. Die Zielstellung der
vorliegenden Arbeit bestand in der Entwicklung einer reproduzierbaren
bioanalytischen Methode und ihrer Anwendung zur Evaluierung der Umsetzbarkeit
einer Quantifizierung von Zytokinen aus dem Mikrodialysat. Ein kommerziell
erhältlicher, durchflusszytometrischer Assay für die ausgewählten
proinflammatorischen Modelzytokine Interleukin-6, Interleukin-8 und den
antiinflammatorischen Mediatoren Interleukin-10 und Tumornekrosefaktor-alpha
konnte erfolgreich für den physiologischen Konzentrationsbereich von 5 bis
10000 pg/mL validiert werden, nachdem er zuvor systematisch auf die
Anforderungen des Mikrodialysats als relevante Matrix angepasst worden war.
In-vitro-Mikrodialyseuntersuchungen zur Zytokingewinnung und –freisetzung über
die Mikrodialysemembran wurden an einem standardisiertem Mikrodialysesystem
durchgeführt. Die Eignung der Systemparameter wurde anhand von
Analytadsorptionserscheinungen an Mikrodialyskatheteroberflächen, von pH-
Effekten, und des Einflusses von variierenden Zytokinkonzentrationen und der
Temperatur des katheterumgebenden Mediums auf die sogenannte ‘Recovery’
untersucht. Eine mit Humanalbuminlösung versetzte Ringerlösung, welche einen
Albumingehalt von 0.5 % aufwies, wurde als Mikroperfusat und äußeres
Untersuchungsmedium für die Mikrodialyse eingesetzt. Die Untersuchungen wurden
mit linearen Mikrodialysekathetern und bei Fließgeschwindigkeiten von 0.3,
0.5, 1.0, 2.0 und 5.0 µL/min durchgeführt. Die In-vitro-Experimente konnten
die Annahme des gleichen Analytaustauschs in beide Richtungen über die
Mikrodialysemembran (Rate der Gewinnung gleich der der Freisetzung)
ausschließlich für Interleukin-8 bestätigen. Die Versuche zur
Analytfreisetzung der restlichen Zytokine zeigten mitunter implausible
Ergebnisse, was zur der Schlussfolgerung führte, dass die übliche In-vivo-
Kalibiermethode für Mikrodialysekatheter, die Retrodialyse, nicht für die
klinischen Anwendung der Mikrodialyse von Zytokinen geeignet ist. Daraufhin
wurde die sogenannte ‘Flow-rate-variation method’, eine schrittweise
Variierung der Fließgeschwindigkeit, für die In-vivo-Studie angewendet.
Daneben wurden die individuellen Zytokinkonzentrationen der über drei
aufeinanderfolgende Tage gewonnenen Mikrodialysatproben analysiert. Das zur
Langzeitanwendung entwickelte Mikrodialysesystem erwies sich als geeignet für
klinische Studien. Das Probenentnahmeschema wurde kritisch evaluiert und
Vorschläge zur Optimierung in künftigen Studien zur Gewinnung der vier
Modelzytokine wurden aufgezeigt. Darüber hinaus sollte die Überwachung von
Zytokinkonzentrationen auf Patientenpopulationen mit beispielsweise mikrobiell
infiziertem Gewebe ausgeweitet und auf ihre mögliche Anwendbarkeit als
prädiktive Biomarkererhebung überprüft werden. Als weitere Option der
Optimisierung von Arzneimitteltherapien wurde die Mikrodialyse zur
Untersuchung der Arzneistoffdistribution ins periphere Gewebe angewendet.
Konzentrationen des Antimykotikums Voriconazol wurden sowohl systemisch als
auch im subkutanen Fettgewebe des Unterbauchs bestimmt und miteinander
verglichen. Voriconazol zeigte in dieser klinischen Studie eine ausgeprägte
Verteilung in das untersuchte Gewebe, in welchem die Zielerreger für die
Arzneimitteltherapie häufig lokalisiert sind. Jedoch wurde eine hohe
Variabilität dieser Arzneistoffverteilung sowie der Akkumulation im System und
im Zielgewebe zwischen den Probanden festgestellt. Die zusätzliche
Genotypisierung der Probanden hinsichtlich des Polymorphismus des
metabolisierenden Isoenzyms CYP2C19 lieferte eingeschränkt evaluierbare Daten
zum Einfluss auf die individuelle Voriconazolexposition. Die präsentierten
Ergebnisse konnten einen merklichen Einfluss auf die zentrale und periphere
Arzneistoffclearance zeigen. Eine weitere Evaluierung der Mikrodialyse zur
Gewinnung von Zytokinen im Rahmen einer Biomarkerüberwachung und die
Kombination dieser Kontrolle von Krankheits- bzw. Therapieeffekten und der
Überprüfung von Arzneistoffkonzentrationen im Zielgewebe können einen
wichtigen Beitrag zur Optimierung von vorhandenen antiinfektiven
Arzneimitteltherapien leisten
Cytokine and Chemokine Recovery Is Increased by Colloid Perfusates during Dermal Microdialysis
Cytokines and chemokines play important roles in cell signalling, and microdialysis is a promising tool for monitoring these inflammation markers ex vivo. Therefore, the collecting of these mediators at the highest concentrations possible is crucial. Depending on the size of the mediator of interest, the collection of these high molecular mass molecules has thus far been difficult due to their low recovery, even when using high cut-off (100 kDa) microdialysis membranes. This study aimed to optimize the recovery of various cytokines and chemokines by validating the use of different perfusates in cutaneous microdialysis, and comparing intravenous (i.v.) colloids, crystalloids, and a lipid emulsion formulations that are approved for i.v. applications. Methods: In vitro and in vivo recovery experiments using six recombinant cytokines varying in molecular size (interleukin-2 (15 kDa), interleukin-6 (20.5 kDa), interleukin-8 (8 kDa), interleukin-12p70 (70 kDa), TNF-α (17.5 kDa), and vascular endothelial growth factor (VEGF) (38 kDa)) were performed in the presence of different perfusates for i.v. applications: Ringer’s lactate, dextran 60 kDa, hydroxyethyl starch 70 kDa, and hydroxyethyl starch 200 kDa solutions as well as a lipid emulsion formulation. Recovery was determined through (i) microdialysis of cytokines and chemokines in Ringer’s lactate solution or human serum in vitro, and (ii) retrodialysis of excised porcine and human skin cadavers in vitro and porcine skin in vivo. Furthermore, we used skin trauma (catheter insertion) and Ultraviolet B irradiation of 3 × 3 cm2 skin areas to sample cytokines and chemokines in vivo and compared the amounts that were obtained using crystalloid and colloid perfusates. All the cytokines and chemokines within the dialysates were quantified through a flow cytometry-based bead array assay. Results: Overall, recovery was strongly increased by the colloids, particularly hydroxyethyl starch 70 kDa, in vitro, ex vivo, and in vivo. When compared with the recovery achieved using Ringer’s lactate, this increase was most effective for proteins ranging from 8 to 20.5 kDa. Hydroxyethyl starch 70 kDa significantly increased the recovery of interleukin (IL)-8 in human serum in vitro when compared with Ringer’s lactate. More cytokines and chemokines were recovered using colloids compared with crystalloids. However, the increase in recovery values was lower for IL-12p70 and VEGF. Conclusions: Regarding the dialysate volumes and final dialysate concentrations, colloid perfusates are overall superior to crystalloid perfusates, such as Ringer’s lactate, when sampling cytokines and chemokines, resulting in higher recoveries. However, the sampling of high-molecular-mass cytokines during microdialysis remains challenging, and experimental in vitro data are not completely comparable with data obtained ex vivo or in vivo