Intrathymic Notch3 and CXCR4 combinatorial interplay facilitates T-cell leukemia propagation.

Notch hyperactivation dominates T-cell acute lymphoblastic leukemia development, but the mechanisms underlying "pre-leukemic-cells" dissemination are still unclear. Here we describe how deregulated Notch3 signaling enhances CXCR4 cell-surface expression and migratory ability of CD4+CD8+ thymocytes, possibly contributing to “pre-leukemic” cell propagation, early in disease progression. In transgenic mice overexpressing the constitutively active Notch3 intracellular domain, we detect the progressive increase in circulating blood and bone marrow of CD4+CD8+-cells, characterized by high and combined surface expression of Notch3 and CXCR4. We report for the first time that transplantation of such CD4+CD8+-cells, reveals their competence in infiltrating spleen and bone marrow of immunocompromised recipient mice. We also show that CXCR4 surface expression is central to the migratory ability of CD4+CD8+-cells and that such an expression is regulated by Notch3 through -arrestin in human leukemia cells. De novo, we propose that hyperactive Notch3 signaling by boosting CXCR4-dependent migration promotes anomalous egression of CD4+CD8+-cells from the thymus in early leukemia stages. In fact, in vivo CXCR4 antagonism prevents bone marrow colonization by such CD4+CD8+ cells in young Notch3 transgenic mice. Therefore, our data suggest that combined therapies precociously counteracting intrathymic Notch3/CXCR4 crosstalk, may prevent dissemination of “pre-leukemic” CD4+CD8+-cells, by a “thymus-autonomous” mechanism

Ruolo di NOTCH3 nella modulazione dell'espressione di CXCR4 nei timociti immaturi

• RIASSUNTO I recettori Notch (N1, N2 e N3) regolano la scelta differenziativa T (Artavanis-Tsakonas et al., 1999). L'attivazione costitutiva del signaling di Notch è una delle maggiori cause dell’insorgenza della leucemia linfoblastica acuta (T-ALL) nel topo e negli esseri umani. La funzione di Notch3 come oncogene nella T-ALL è stata dimostrata da un modello murino creato nel nostro laboratorio, caratterizzato dall’espressione costitutiva della forma attiva di Notch3 (N3-IC) nei timociti immaturi (N3-IC Tg) (Bellavia et al., 2000). Nei topi N3-IC Tg è stata osservata una deregolazione della proliferazione e della maturazione nella fase di transizione da preT a T, oltre all'attivazione costitutiva del preTCR (Bellavia et al., 2002). Il differenziamento delle cellule T dipende da molti segnali forniti dallo stroma, il quale produce citochine, chemochine e ligandi e sostiene i processi maturativi timocitari all'interno del micro-ambiente timico (Sun et al., 2010). In particolare è noto che il recettore di chemochine CXCR4 è espresso sulla superficie dei timociti dallo stadio DN1 (doppi negativi 1) a quello DP (doppi positivi), con un picco di espressione nelle transizioni DN2-DN3 e DN-DP, mentre è completamente assente nei SP (singolo positivi) (Plotkin et al., 2003). Ѐ altresì dimostrato che il signaling cooperativo fra il preTCR, CXCR4 e Notch3 è richiesto nella selezione β per consentire il differenziamento dei timociti T dallo stadio DN a quello DP (Janas et al., 2010). Infatti il fattore derivato dalle cellule stromali SDF-1 (CXCL12) ed il suo recettore CXCR4 promuovono la sopravvivenza dei timociti DN e regolano la migrazione durante la transizione da DN a DP (Plotkin et al., 2003). Inoltre è stato suggerito un ruolo dell'asse CXCR4/SDF-1 nello sviluppo e nella progressione della T-ALL (Scupoli et al., 2008). Scopo della Tesi di Dottorato è stato lo studio del cross-talk molecolare della via di segnalazione, innescata dall’over-espressione di Notch3 sulla pathway della chemochina CXCR4, come possibile meccanismo deregolatore dei programmi differenziativi intratimici in un modello murino di T-ALL. Esperimenti al FACS hanno dimostrato una diminuzione nella percentuale di cellule DN CXCR4 positive nel topo N3-IC Tg rispetto al wt, non attribuibile ad alcuna riduzione nel numero totale di timociti DN. Al contrario è stato osservato un incremento dell’espressione di CXCR4 nelle cellule DP. Esperimenti di migrazione ex vivo dei timociti, in risposta al ligando fisiologico, CXCL12, dimostrano una alterata migrazione dei timociti dei topi N3-IC Tg rispetto al wt. Inoltre sono stati eseguiti esperimenti di cell sorting focalizzati all’analisi molecolare della sottopopolazione timocitaria delle DN. I dati sembrano suggerire che l’over-espressione di Notch3 possa compromettere eventi iniziali nella maturazione delle cellule pre-T, riducendo anche l’espressione di EpCAM, una molecola di adesione omotipica coinvolta nell’interazione linfo/stromale del timo. Supponiamo che questi eventi possano essere coinvolti nello sviluppo della T-ALL

Ruolo di NOTCH3 nella modulazione dell'espressione di CXCR4 nei timociti immaturi

• RIASSUNTO I recettori Notch (N1, N2 e N3) regolano la scelta differenziativa T (Artavanis-Tsakonas et al., 1999). L'attivazione costitutiva del signaling di Notch è una delle maggiori cause dell’insorgenza della leucemia linfoblastica acuta (T-ALL) nel topo e negli esseri umani. La funzione di Notch3 come oncogene nella T-ALL è stata dimostrata da un modello murino creato nel nostro laboratorio, caratterizzato dall’espressione costitutiva della forma attiva di Notch3 (N3-IC) nei timociti immaturi (N3-IC Tg) (Bellavia et al., 2000). Nei topi N3-IC Tg è stata osservata una deregolazione della proliferazione e della maturazione nella fase di transizione da preT a T, oltre all'attivazione costitutiva del preTCR (Bellavia et al., 2002). Il differenziamento delle cellule T dipende da molti segnali forniti dallo stroma, il quale produce citochine, chemochine e ligandi e sostiene i processi maturativi timocitari all'interno del micro-ambiente timico (Sun et al., 2010). In particolare è noto che il recettore di chemochine CXCR4 è espresso sulla superficie dei timociti dallo stadio DN1 (doppi negativi 1) a quello DP (doppi positivi), con un picco di espressione nelle transizioni DN2-DN3 e DN-DP, mentre è completamente assente nei SP (singolo positivi) (Plotkin et al., 2003). Ѐ altresì dimostrato che il signaling cooperativo fra il preTCR, CXCR4 e Notch3 è richiesto nella selezione β per consentire il differenziamento dei timociti T dallo stadio DN a quello DP (Janas et al., 2010). Infatti il fattore derivato dalle cellule stromali SDF-1 (CXCL12) ed il suo recettore CXCR4 promuovono la sopravvivenza dei timociti DN e regolano la migrazione durante la transizione da DN a DP (Plotkin et al., 2003). Inoltre è stato suggerito un ruolo dell'asse CXCR4/SDF-1 nello sviluppo e nella progressione della T-ALL (Scupoli et al., 2008). Scopo della Tesi di Dottorato è stato lo studio del cross-talk molecolare della via di segnalazione, innescata dall’over-espressione di Notch3 sulla pathway della chemochina CXCR4, come possibile meccanismo deregolatore dei programmi differenziativi intratimici in un modello murino di T-ALL. Esperimenti al FACS hanno dimostrato una diminuzione nella percentuale di cellule DN CXCR4 positive nel topo N3-IC Tg rispetto al wt, non attribuibile ad alcuna riduzione nel numero totale di timociti DN. Al contrario è stato osservato un incremento dell’espressione di CXCR4 nelle cellule DP. Esperimenti di migrazione ex vivo dei timociti, in risposta al ligando fisiologico, CXCL12, dimostrano una alterata migrazione dei timociti dei topi N3-IC Tg rispetto al wt. Inoltre sono stati eseguiti esperimenti di cell sorting focalizzati all’analisi molecolare della sottopopolazione timocitaria delle DN. I dati sembrano suggerire che l’over-espressione di Notch3 possa compromettere eventi iniziali nella maturazione delle cellule pre-T, riducendo anche l’espressione di EpCAM, una molecola di adesione omotipica coinvolta nell’interazione linfo/stromale del timo. Supponiamo che questi eventi possano essere coinvolti nello sviluppo della T-ALL

Multidrug Resistance Protein-4 Influences Aspirin Toxicity in Human Cell Line

Overexpression of efflux transporters, in human cells, is a mechanism of resistance to drug and also to chemotherapy. We found that multidrug resistance protein-4 (MRP4) overexpression has a role in reducing aspirin action in patients after bypass surgery and, very recently, we found that aspirin enhances platelet MRP4 levels through peroxisome proliferator activated receptor-α (PPARα). In the present paper, we verified whether exposure of human embryonic kidney-293 cells (Hek-293) to aspirin modifies MRP4 gene expression and its correlation with drug elimination and cell toxicity. We first investigated the effect of high-dose aspirin in Hek-293 and we showed that aspirin is able to increase cell toxicity dose-dependently. Furthermore, aspirin effects, induced at low dose, already enhance MRP4 gene expression. Based on these findings, we compared cell viability in Hek-293, after high-dose aspirin treatment, in MRP4 overexpressing cells, either after aspirin pretreatment or in MRP4 transfected cells; in both cases, a decrease of selective aspirin cell growth inhibition was observed, in comparison with the control cultures. Altogether, these data suggest that exposing cells to low nontoxic aspirin dosages can induce gene expression alterations that may lead to the efflux transporter protein overexpression, thus increasing cellular detoxification of aspirin

Notch3 and canonical NF-κB signaling pathways cooperatively regulate Foxp3 transcription

Notch3 overexpression has been previously shown to positively regulate the generation and function of naturally occurring regulatory T cells and the expression of Foxp3, in cooperation with the pTα/pre-TCR pathway. In this study, we show that Notch3 triggers the trans activation of Foxp3 promoter depending on the T cell developmental stage. Moreover, we discovered a novel CSL/NF-κB overlapping binding site within the Foxp3 promoter, and we demonstrate that the activation of NF-κB, mainly represented by p65-dependent canonical pathway, plays a positive role in Notch3-dependent regulation of Foxp3 transcription. Accordingly, the deletion of protein kinase Cθ, which mediates canonical NF-κB activation, markedly reduces regulatory T cell number and per cell Foxp3 expression in transgenic mice with a constitutive activation of Notch3 signaling. Collectively, our data indicate that the cooperation among Notch3, protein kinase Cθ, and p65/NF-κB subunit modulates Foxp3 expression, adding new insights in the understanding of the molecular mechanisms involved in regulatory T cell homeostasis and function. Copyright © 2011 by The American Association of Immunologists, Inc