Molekulargenetische und funktionelle Analysen des LRP5-Gens bei einem Osteoporosis-Pseudoglioma-Syndrom-ähnlichen Phänotyp

Durch positionelle Klonierung sollte das verantwortliche Gen für das in einer türkischen Familie vorliegende Fehlbildungssyndrom mit Augenfehlbildungen, einer progressiven Muskelatrophie und milden mentalen Retardierung identifiziert werden. Es wurde eine Compound-Heterozygotie für zwei neuartige Mutationen im Transmembranrezeptor LRP5 identifiziert, der als Co-Rezeptor in der WNT/NDP-Signalkaskade fungiert und auch beim autosomal-rezessiv erblichen Osteoporosis-Pseudoglioma-Syndrom mutiert ist. Die erste Mutation war eine heterozygote in-frame 18 bp-Deletion innerhalb eines für das LRP5-Signalpeptid kodierenden CTG-Repeats, wodurch 3 anstatt 9 Leucine im Signalpeptid des mutierten Allels (Mut3L) vorlagen. Die zweite Mutation war eine intragenische Deletion von ca. 8,2 kb. Diese führte auf mRNA-Ebene zu einer Deletion der Exons 14 bis 16 mit einem präterminalen Stop und folglich zu einem trunkierten Protein. Anhand unabhängiger funktioneller in vitro-Analysen wurde der zelluläre Pathomechanismus beider mutierter LRP5-Proteine aufgeklärt. Beide mutierten LRP5-Rezeptoren wurden stabil exprimiert, unterlagen allerdings einem aberranten intrazellulären Transport und konnten nicht in die Plasmamembran gelangen, um Signale entlang des WNT/NDP-Signalweges zu transduzieren. Die Signalpeptid-Mutation verhinderte den cotranslationalen Transport in das ER, so dass der Rezeptor ausschließlich im Cytoplasma lokalisiert war. Das OPPG-Syndrom untypische klinische Erscheinungsbild der Familie (Vorliegen einer muskulären Atrophie bei Abwesenheit einer stark ausgeprägten Osteoporose) lässt sich möglicherweise teilweise auf die neuartigen LRP5-Mutationstypen zurückführen. Im Rahmen der Genotypisierung gesunder Kontroll-Individuen bestätigte sich, dass der Leucin-Stretch des LRP5-Signalpeptides polymorph war, wobei 90% aller Allele 9 Leucine im Signalpeptid aufwiesen. Funktionelle Analysen der bei Kontroll-Individuen detektierten seltenen Signalpeptid-Varianten mit 6 bis 11 Leucinen ergaben, dass sowohl eine Verlängerung als auch eine Verkürzung des Signalpeptids dazu führten, dass weniger funktionsfähige Rezeptormoleküle gebildet wurden. Ursache war, dass jeweils ein steigender Anteil der Proteinsynthese nicht mehr im ER, sondern im Cytoplasma erfolgte. Ein Teil der LRP5-Moleküle konnte nicht in die Zellmembran gelangen. Damit konnte erstmals ein quantitativer Effekt eines hochvariablen Sequenzelementes im Signalpeptid eines Proteins auf die Effektivität der Proteintranslation experimentell demonstriert werden. Da genomweit durch eine bioinformatische Analyse fast 400 weitere humane Proteine identifiziert werden konnten, die Bereiche mit mindestens 5 Leucinen im Signalpeptid aufwiesen, könnte dieser Mechanismus eine nicht unbedeutende Ursache für die interindividuelle Variabilität der Proteintranslation und -expression darstellen und auch für die Genese komplexgenetischer Erkrankungen relevant sein. Ein weiterer Teil dieser Doktorarbeit bestand darin, den molekulargenetischen und zellulären Pathomechanismus bei einer zweiten konsanguinen türkischen Familie aufzuklären, in der zwei Betroffene ein typisches Osteoporosis-Pseudoglioma-Syndrom aufwiesen. Es konnte in dieser Familie eine pathogene homozygote LRP5-Mutation identifiziert werden, die innerhalb der Familie mit dem Phänotyp co-segregierte. In Kontroll-Individuen war diese nicht nachweisbar. Es handelte sich um einen homozygoten Basenaustausch an Position +4 der Donor Splice Site in Intron 7. Analysen an Patienten-RNA zeigten, dass infolge dieses Basenaustausches statt der ursprünglichen Splice Site eine 63 bp 3´-gelegene kryptische Splice Site verwendet wurde. Auf Proteinebene führte dies zu einer in frame-Insertion von 21 zusätzlichen Aminosäuren. Funktionelle in vitro-Analysen dieses mutierten LRP5-Proteins ergaben, dass es einem aberranten intrazellulärem Transport unterlag und folglich nicht mehr in der Lage war, Signale entlang der WNT/NDP-Signalkaskade zu transduzieren. Da im humanen Genom ein exprimiertes und prozessiertes Pseudogen für LRP5 annotiert ist, wurde experimentell überprüft, ob LRP5 durch einen auf RNA-Interferenz beruhenden Mechanismus vom seinem LRP5L-Pseudogen reguliert wird. Die bislang unbekannte Struktur, Größe und Orientierung des LRP5L-Transkriptes wurde mit Hilfe von Datenbank-Analysen und RACE-PCR-Experimenten aufgeklärt. Das LRP5L-Pseudogen besteht aus sieben Exons, die insgesamt 1740 bp umfassen. Der größte offene Leserahmen beträgt 756 bp. Mittels Expressiopnsanalysen wurde gezeigt, das LRP5L in den Geweben Herz, Lunge, Niere, Dünndarm, Colon, Milz, Thymus, Leukozyten und Pankreas unterschiedlich relativ stark exprimiert wird. Die Hypothese einer trans-Regulation von LRP5 durch sein Pseudogen konnte weder mit Hilfe eines Luciferase Reporter Assays (Co-Transfektion von Expressionskonstrukten für LRP5L und LRP5) noch durch RNAi-Analysen (Zellinien mit endogener LRP5L- und LRP5- Expression) in vitro bestätigt werden

CHD1L: a new candidate gene for congenital anomalies of the kidneys and urinary tract (CAKUT)

Background. Recently, we identified a microduplication in chromosomal band 1q21.1 encompassing the CHD1L/ALC1 gene encoding a chromatin-remodelling enzyme in congenital anomalies of the kidneys and urinary tract (CAKUT) patient. Methods. To explore the role of CHD1L in CAKUT, we screened 85 CAKUT patients for mutations in the CHD1L gene and performed functional analyses of the three heterozygous missense variants detected. In addition, we quantitatively determined CHD1L expression in multiple human fetal and adult tissues and analysed expression of CHD1L protein in human embryonal, adult and hydronephrotic kidney sections. Results. Two of three novel heterozygous missense variants identified in three patients were not found in >400 control chromosomes. All variants lead to amino acid substitutions in or near the CHD1L macro domain, a poly-ADP-ribose (PAR)-binding module interacting with PAR polymerase 1 (PARP1), and showed decreased interaction with PARP1 by pull-down assay of transfected cell lysates. Quantitative messenger RNA analysis demonstrated high CHD1L expression in human fetal kidneys, and levels were four times higher than in adult kidneys. In the human embryo at 7-11 weeks gestation, CHD1L immunolocalized in the early ureteric bud and the S- and comma-shaped bodies, critical stages of kidney development. In normal postnatal sections, CHD1L was expressed in the cytoplasm of tubular cells in all tubule segments. CHD1L expression appeared higher in the hydronephrotic kidney of one patient with a hypofunctional CHD1L variant than in normal kidneys, recapitulating high fetal levels. Conclusion. Our data suggest that CHD1L plays a role in kidney development and may be a new candidate gene for CAKU

CHD1L: a new candidate gene for congenital anomalies of the kidneys and urinary tract (CAKUT)

Recently, we identified a microduplication in chromosomal band 1q21.1 encompassing the CHD1L/ALC1 gene encoding a chromatin-remodelling enzyme in congenital anomalies of the kidneys and urinary tract (CAKUT) patient