Μελέτη αιμοποίησης σε νεογνά , βρέφη, παιδιά.Αξξιολόγηση δράσησς κυτταροκινών.Χρόνια καλοήθης ουδετεροπενία της βρεφικής και παιδικής ηλικίας.

Chronic benign neutropenia of infancy and childhood is a primary disorder of autoimmune origin considered to be the most common form of neutropenia in this age group. The cause of the immune mechanism as well as the potential regulatory role of G-CSF have not been elucidated. The aim of this study was to investigate the response of the bone marrow to peripheral cytopenia and to evaluate the role of G-CSF and the adhesion molecules ICAM-1 and E-selectin as markers of endothelial cell activation in the pathogenesis of chronic benign neutropenia and in the differentiation from secondary neutropenias of different origin. G-CSF regulates proliferation and differentiation of hemopoietic progenitor cells and enhances the functional integrity and survival of mature neutrophils. The adhesion molecules ICAM-1 and E-selectin are expressed on the vascular endothelial cells upon activation with IL-1β and TNF-α and enable rolling, firm adhesion, extravasation and migration of neutrophils into the tissues in sites of inflammation. Thirty-five children with primary benign neutropenia at diagnosis and 30 children of similar age with normal neutrophil count and without malignancy or infection used as controls were studied. The group of secondary neutropenia consisted of 25 children with acute leukemia in remission, 16 of which had developed neutropenia as a result of chemotherapy. The methods used included hemopoietic progenitor cells colony growth, replating of CFU-GM of the seventh day of the culture and ELISA for the detection of serum levels of G-CSF, ICAM-1, E-selectin, TNF-α and IL-1β. The replating capacity of CFU-GM is related to the ability of bone marrow to generate mature neutrophils and is estimated by the number and the distribution of secondary CFU-GM colonies. The results showed that in chronic benign neutropenia both the number (p=0.29) and the replating capacity of CFU-GM (p=0.12) were normal when all the cases were taken into account. The latter increased significantly in cases of severe neutropenias related to both normals (p=0.03) and the mild neutropenias (p=0.009). For the total of cases, replating capacity of CFU-GM did not correlate with the absolute neutrophil count (r = - 0.45, p = 0. 26), serum levels of G-CSF (r=0.24, p=0.5) or the age at the onset of disease (r = - 0.2, p=0.5). In secondary chemotherapy-associated neutropenia, the replating capacity of CFU-GM did not increase (p=0.2) and inversely correlated with the number of circulating neutrophils (r = - 0.64, p=0.02). In chronic benign neutropenia serum ICAM-1 and E-selectin levels positively correlated with each other (r=0.55, p=0.015) and inversely with the absolute neutrophil count (r= -0.64, p=0.003, r= -0.5, p= 0.04 for ICAM-1 and Ε-selectin respectively). In the group of acute leukemia in remission the onset of neutropenia did not influence serum ICAM-1 or E-selectin levels (p=0.3, p=0.14 respectively). In the group of secondary neutropenia serum ICAM-1 and E-selectin levels were significantly lower than the respective levels in the group of benign neutropenias (p<0.001 for both the adhesion molecules studied) and did not correlate with the number of neutrophils in the peripheral blood. Serum TNF-α and IL-1β levels in benign neutropenias were found increased as compared with normal levels (p=0.01, p=0.04 respectively) and the corresponding values in secondary neutropenias (p<0.001, p=0.5 respectively) and inversely correlated with the number of circulating neutrophils (r = -0.58, p=0.01 for TNF-α and r = -0.62, p=0.04 for IL-1β). Serum TNF-α levels positively correlated with ICAM-1 (r= 0.67, p<0.01) and G-CSF levels (r=0.65, p=0.01). Serum IL-1β levels positively correlated with E-selectin (r=0.67, p=0.04) and G-CSF levels (r=0.67, p=0.04). Endogenous serum G-CSF levels in children with benign neutropenia at diagnosis were widely distributed and the majority of them were within normal range. In mean values they did not differ from normal levels in a statistically significant manner (p=0.05). In cases of severe neutropenia serum G-CSF levels significantly increased (p=0.02) but in the total of cases they did not correlate with the number of white blood cells (r= - 0.27, p=0.3) or that of neutrophils in the peripheral blood (r= -0.2, p=0.4). Serum ICAM-1 levels (r= 0.53, p=0.01) and the number of peripheral monocytes (r=0.56, p=0.03) positively correlated with G-CSF levels. The mean serum G-CSF level in the group of patients with acute leukemia in remission irrespectively of neutropenia was low and did not differ from the corresponding normal mean level (p=0.26). In conclusion, in chronic benign neutropenia of childhood hematopoietic progenitor cells of granulocytic origin are normal in number and show increased self-proliferative capacity in the severe cases, related to their ability to generate mature neutrophils. The degree of neutropenia correlates with serum ICAM-1 and E-selectin levels markers indicative of an activated endothelium. Serum TNF-α and IL-1β levels that induce the activation of endothelial cells and G-CSF production are increased compared with normal levels and positively correlate with the degree of neutropenia. Serum G-CSF levels show a wide distribution of values and in the majority of cases are within normal levels and are not regulated upon the number of circulating neutrophils in the peripheral blood. G-CSF seems to act as an inducer of the activation of endothelium. The previous findings are indicative of the existence of a latent, low-grade inflammatory process in the cases of severe chronic benign neutropenia.Η χρόνια καλοήθης ουδετεροπενία της βρεφικής και παιδικής ηλικίας αποτελεί την πιο συχνή μορφή ουδετεροπενίας των παιδιών. Θεωρείται πρωτοπαθής διαταραχή αυτοάνοσης αιτιολογίας αλλά το αίτιο που πυροδοτεί τον ανοσολογικό μηχανισμό παραμένει αδιευκρίνιστο. Σκοπός της μελέτης ήταν η ποσοτική και ποιοτική αξιολόγηση των προγονικών κυττάρων της κοκκιώδους σειράς για να διερευνηθεί πως αντιδρά ο μυελός των οστών στην κυτταροπενία και ο προσδιορισμός του ρόλου του ενδογενούς αυξητικού παράγοντα των κοκκιοκυττάρων (G-CSF) και των μορίων προσκόλλησης ICAM-1 και Ε-σελεκτίνης στην παθογένεια της χρόνιας καλοήθους ουδετεροπενίας των παιδιών και στη διαφοροποίησή της από δευτεροπαθείς ουδετεροπενίες διαφορετικής αρχής. Ο G-CSF επάγει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων και προάγει τη λειτουργικότητα και την επιβίωση των ώριμων ουδετερόφιλων, ενώ τα μόρια προσκόλλησης ICAM-1 και Ε-σελεκτίνη εκφράζονται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων μετά από ενεργοποίηση με IL-1β και TNF-α διευκολύνοντας τη διολίσθηση, την προσκόλληση, την εξαγγείωση και τη μετανάστευση των ουδετεροφίλων στους ιστούς σε θέσεις φλεγμονής. Μελετήθηκαν 35 παιδιά με πρωτοπαθή καλοήθη ουδετεροπενία στη διάγνωση. Για τη μελέτη της δευτεροπαθούς ουδετεροπενίας χρησιμοποιήθηκαν 25 παιδιά με οξεία λευχαιμία (23 ΟΛΛ, 2 ΟΜΛ) σε ύφεση, 16 από τα οποία είχαν εκδηλώσει ουδετεροπενία λόγω μυελοτοξικής δράσης της χημειοθεραπείας. Την ομάδα ελέγχου αποτέλεσαν 30 παιδιά αντίστοιχης ηλικίας χωρίς κακόηθες νόσημα ή ουδετεροπενία ή εστία λοίμωξης στα οποία το μυελόγραμμα έγινε στα πλαίσια διερεύνησης της νόσου τους. Έγιναν καλλιέργειες μονοπύρηνων κυττάρων του μυελού των οστών σε μεθυλοκυτταρίνη για την εκτίμηση του παραγόμενου αριθμού αποικιών προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων της κοκκιώδους και της ερυθράς σειράς (CFU-GM και BFU-E αντίστοιχα). Για την εκτίμηση της επαναπολλαπλασιαστικής ικανότητας των CFU-GM που σχετίζεται με την ικανότητα του μυελού να παράγει ώριμα ουδετερόφιλα έγιναν ανακαλλιέργειες CFU-GM την έβδομη μέρα της καλλιέργειας και υπολογισμός του αριθμού και της κατανομής των δευτερογενών αποικιών. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων στον ορό του G-CSF, των διαλυτών μορίων προσκόλλησης ICAM-1 και Ε-σελεκτίνης και των κυτταροκινών που επάγουν την έκφρασή τους στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων TNF-α και IL-1β χρησιμοποιήθηκε η ανοσοενζυμική τεχνική ELISA. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι στη χρόνια καλοήθη ουδετεροπενία είναι φυσιολογικός ο αριθμός (p=0.29) και η επαναπολλαπλασιαστική ικανότητα των CFU-GM στο σύνολο των περιπτώσεων (p=0.12). Η τελευταία αυξάνεται στατιστικώς σημαντικά στις περιπτώσεις σοβαρής ουδετεροπενίας με ΑΑΠ<500 (p=0.03). Στο σύνολο των περιπτώσεων δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση της επαναπολλαπλασιαστικής ικανότητας των CFU-GM με τον απόλυτο αριθμό πολυμορφοπυρήνων (r = - 0.45, p = 0. 26), με τα επίπεδα του G-CSF στον ορό (r=0.24, p=0.5) ή με την ηλικία διάγνωσης της νόσου (r = -0.2, p=0.5). Στις δευτεροπαθείς ουδετεροπενίες μετά από χημειοθεραπεία η επαναπολλαπλασιαστική ικανότητα των CFU-GM παραμένει φυσιολογική (p=0.2), αλλά σχετίζεται αρνητικά με τον αριθμό των κυκλοφορούντων ουδετεροφίλων (r = - 0.64, p=0.02). Τα επίπεδα του ICAM-1 και της Ε-σελεκτίνης σχετίζονται θετικά μεταξύ τους (r=0.55, p=0.015) και ισχυρώς αρνητικά με τον απόλυτο αριθμό πολυμορφοπυρήνων (r= -0.64, p=0.003, r= -0.5, p= 0.04 για το ICAM-1 και την Ε-σελεκτίνη αντίστοιχα). Στην ομάδα της οξείας λευχαιμίας σε ύφεση η εκδήλωση ουδετεροπενίας δεν επηρέασε τις τιμές των επιπέδων των εν λόγω μορίων στον ορό των ασθενών (p=0.14, p=0.3 αντίστοιχα για την Ε-σελεκτίνη και το ICAM-1). Τα επίπεδα των δύο μορίων προσκόλλησης στην ομάδα της δευτεροπαθούς ουδετεροπενίας είναι σημαντικά χαμηλότερα σε σύγκριση με τα επίπεδα στον ορό των ασθενών με χρόνια καλοήθη ουδετεροπενία (p<0.001 και για τα δύο μόρια) και δε σχετίζονται με τον απόλυτο αριθμό πολυμορφοπυρήνων. Τα επίπεδα του TNF-α και της IL-1β στον ορό των ασθενών με χρόνια καλοήθη ουδετεροπενία είναι αυξημένα συγκριτικά με τα επίπεδα των φυσιολογικών (p=0.01, p=0.04 αντίστοιχα) και των δευτεροπαθών ουδετεροπενιών (p<0.001, p=0.5 αντίστοιχα) και σχετίζονται ισχυρώς αρνητικά με τον αριθμό των κυκλοφορούντων ουδετεροφίλων (r = -0.58, p=0.01 για τον TNF-α και r = -0.62, p=0.04 για την IL-1β). Τα επίπεδα του TNF-α σχετίζονται θετικά με τα επίπεδα του ICAM-1 και του G-CSF στον ορό (r= 0.67, p<0.01 και r=0.65, p=0.01 αντίστοιχα). Τα επίπεδα της IL-1β σχετίζονται θετικά με τα επίπεδα της Ε-σελεκτίνης και του G-CSF στον ορό (r= 0.67, p=0.04 και r=0.67, p=0.04 αντίστοιχα). Τα επίπεδα του G-CSF στον ορό των παιδιών με χρόνια καλοήθη ουδετεροπενία στη διάγνωση παρουσίασαν μεγάλη διακύμανση τιμών και η πλειοψηφία αυτών κυμαίνονταν μέσα στο εύρος του φυσιολογικού. Η μέση τιμή της συγκέντρωσης G-CSF στον ορό δε διέφερε στατιστικώς σημαντικά από τα φυσιολογικά επίπεδα (p=0.05). Τα επίπεδα του G-CSF ήταν αυξημένα στην ομάδα της σοβαρής ουδετεροπενίας (p=0.02) αλλά στο σύνολο των περιστατικών δε βρέθηκε ισχυρή συσχέτιση των επιπέδων G-CSF με τον αριθμό των λευκοκυττάρων (r= - 0.27, p=0.3) ή με τον απόλυτο αριθμό πολυμορφοπυρήνων (r= -0.2, p=0.4). Τα επίπεδα του G-CSF σχετίζονται θετικά με τα επίπεδα του διαλυτού ICAM-1 στον ορό (r= 0.53, p=0.01) και με τον αριθμό των μονοκυττάρων στο περιφερικό αίμα (r=0.56, p=0.03). Η μέση τιμή της συγκέντρωσης του ενδογενούς G-CSF στην ύφεση της οξείας λευχαιμίας ανεξαρτήτως ουδετεροπενίας ήταν χαμηλή και δεν διέφερε από την αντίστοιχη τιμή των φυσιολογικών (p=0.26). Συμπερασματικά, στη χρόνια καλοήθη ουδετεροπενία των παιδιών η διαταραχή αφορά τα ώριμα πολυμορφοπύρηνα και δεν επηρεάζει ποσοτικά τα προγονικά κύτταρα της κοκκιώδους σειράς τα οποία παρουσιάζουν αυξημένη επαναπολλαπλασιαστική ικανότητα στις περιπτώσεις σοβαρής ουδετεροπενίας Ο βαθμός της ουδετεροπενίας σχετίζεται θετικά με τα επίπεδα της Ε-σελεκτίνης και του ICAM-1 στον ορό των ασθενών. Τα επίπεδα του TNF-α και της IL-1β που επάγουν την ενεργοποίηση του ενδοθηλίου και την έκφραση των δύο μορίων προσκόλλησης στην επιφάνειά του και την παραγωγή G-CSF είναι αυξημένα στον ορό των ασθενών συγκρινόμενα με τα φυσιολογικά και σχετίζονται θετικά με το βαθμό της ουδετεροπενίας. Τα επίπεδα του G-CSF παρουσιάζουν μεγάλο εύρος κατανομής αλλά στην πλειοψηφία των περιπτώσεων κυμαίνονται εντός των φυσιολογικών ορίων και δε ρυθμίζονται ανάλογα με τον αριθμό των κυκλοφορούντων ουδετεροφίλων. Η συγκέντρωσή του G-CSF στον ορό σχετίζεται με την ενεργοποίηση του ενδοθηλίου. Οι ενδείξεις συμμετοχής του ενεργοποιημένου ενδοθηλίου στην εκδήλωση σοβαρής καλοήθους ουδετεροπενίας θέτουν την υποψία συνυπάρχουσας, λανθάνουσας υποκλινικής φλεγμονής

Study of hemopoiesis in neonates, infants and children: evaluation of the role and action of cytokines: the case of chronic benign neutropenia of infancy and childhood

Chronic benign neutropenia of infancy and childhood is a primary disorder of autoimmune origin considered to be the most common form of neutropenia in this age group. The cause of the immune mechanism as well as the potential regulatory role of G-CSF have not been elucidated. The aim of this study was to investigate the response of the bone marrow to peripheral cytopenia and to evaluate the role of G-CSF and the adhesion molecules ICAM-1 and E-selectin as markers of endothelial cell activation in the pathogenesis of chronic benign neutropenia and in the differentiation from secondary neutropenias of different origin. G-CSF regulates proliferation and differentiation of hemopoietic progenitor cells and enhances the functional integrity and survival of mature neutrophils. The adhesion molecules ICAM-1 and E-selectin are expressed on the vascular endothelial cells upon activation with IL-1β and TNF-α and enable rolling, firm adhesion, extravasation and migration of neutrophils into the tissues in sites of inflammation. Thirty-five children with primary benign neutropenia at diagnosis and 30 children of similar age with normal neutrophil count and without malignancy or infection used as controls were studied. The group of secondary neutropenia consisted of 25 children with acute leukemia in remission, 16 of which had developed neutropenia as a result of chemotherapy. The methods used included hemopoietic progenitor cells’ colony growth, replating of CFU-GM of the seventh day of the culture and ELISA for the detection of serum levels of G-CSF, ICAM-1, E-selectin, TNF-α and IL-1β. The replating capacity of CFU-GM is related to the ability of bone marrow to generate mature neutrophils and is estimated by the number and the distribution of secondary CFU-GM colonies. The results showed that in chronic benign neutropenia both the number (p= 0.29) and the replating capacity of CFU-GM (p= 0.12) were normal when all the cases were taken into account. The latter increased significantly in cases of severe neutropenias related to both normals (p= 0.03) and the mild neutropenias (p= 0.009). For the total of cases, replating capacity of CFU-GM did not correlate with the absolute neutrophil count (r = - 0.45, p= 0.26), serum levels of G-CSF (r= 0.24, p= 0.5) or the age at the onset of disease (r= - 0.2, p= 0.5). In secondary chemotherapy-associated neutropenia, the replating capacity of CFU-GM did not increase (p= 0.2) and inversely correlated with the number of circulating neutrophils(r= - 0.64, p= 0.02). In chronic benign neutropenia serum ICAM-1 and E-selectin levels positively correlated with each other (r=0.55, p= 0.015) and inversely with the absolute neutrophil count (r= -0.64, p= 0.003, r= -0.5, p= 0.04 for ICAM-1 and Ε-selectin respectively). In the group of acute leukemia in remission the onset of neutropenia did not influence serum ICAM-1 or E-selectin levels (p= 0.3, p= 0.14 respectively). In the group of secondary neutropenia serum ICAM-1 and E-selectin levels were significantly lower than the respective levels in the group of benign neutropenias (p<0.001 for both the adhesion molecules studied) and did not correlate with the number of neutrophils in the peripheral blood. Serum TNF-α and IL-1β levels in benign neutropenias were found increased as compared with normal levels (p= 0.01, p= 0.04 respectively) and the corresponding values in secondary neutropenias (p<0.001, p= 0.5 respectively) and inversely correlated with the number of circulating neutrophils (r = -0.58, p= 0.01 for TNF-αand r = -0.62, p= 0.04 for IL-1β). Serum TNF-α levels positively correlated with ICAM-1 (r= 0.67, p<0.01) and G-CSF levels (r= 0.65, p= 0.01). Serum IL-1β levels positively correlated with E-selectin (r= 0.67, p= 0.04) and G-CSF levels (r= 0.67, p= 0.04). Endogenous serum G-CSF levels in children with benign neutropenia at diagnosis were widely distributed and the majority of them were within normal range. In mean values they did not differ from normal levels in a statistically significant manner (p=0.05). In cases of severe neutropenia serum G-CSF levels significantly increased (p= 0.02) but in the total of cases they did not correlate with the number of white blood cells (r= - 0.27, p= 0.3) or that of neutrophils in the peripheral blood (r= -0.2, p= 0.4). Serum ICAM-1 levels (r= 0.53, p= 0.01) and the number of peripheral monocytes (r= 0.56, p= 0.03) positively correlated with G-CSF levels. The mean serum G-CSF level in the group of patients with acute leukemia in remission irrespectively of neutropenia was low and did not differ from the corresponding normal mean level (p= 0.26). In conclusion, in chronic benign neutropenia of childhood hematopoietic progenitor cells of granulocytic origin are normal in number and show increased self-proliferative capacity in the severe cases, related to their ability to generate mature neutrophils. The degree of neutropenia correlates with serum ICAM-1 and E-selectin levels markers indicative of an activated endothelium. Serum TNF-α and IL-1β levels that induce the activation of endothelial cells and G-CSF production are increased compared with normal levels and positively correlate with the degree of neutropenia. Serum G-CSF levels show a wide distribution of values and in the majority of cases are within normal levels and are not regulated upon the number of circulating neutrophils in the peripheral blood. G-CSF seems to act as an inducer of the activation of endothelium. The previous findings are indicative of the existence of a latent, low-grade inflammatory process in the cases of severe chronic benign neutropenia.Η χρόνια καλοήθης ουδετεροπενία της βρεφικής και παιδικής ηλικίας αποτελεί την πιο συχνή µορφή ουδετεροπενίας των παιδιών. Θεωρείται πρωτοπαθής διαταραχή αυτοάνοσης αιτιολογίας αλλά το αίτιο που πυροδοτεί τον ανοσολογικό µηχανισµό παραµένει αδιευκρίνιστο. Σκοπός της µελέτης ήταν η ποσοτική και ποιοτική αξιολόγηση των προγονικών κυττάρων της κοκκιώδους σειράς για να διερευνηθεί πως αντιδρά ο µυελός των οστών στην κυτταροπενία και ο προσδιορισµός του ρόλου του ενδογενούς αυξητικού παράγοντα των κοκκιοκυττάρων (G-CSF) και των µορίων προσκόλλησης ICAM-1 και Ε-σελεκτίνης στην παθογένεια της χρόνιας καλοήθους ουδετεροπενίας των παιδιών και στη διαφοροποίησή της από δευτεροπαθείς ουδετεροπενίες διαφορετικής αρχής. Ο G-CSF επάγει τον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων και προάγει τη λειτουργικότητα και την επιβίωση των ώριµων ουδετερόφιλων, ενώ τα µόρια προσκόλλησης ICAM-1 και Ε- σελεκτίνη εκφράζονται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων µετά από ενεργοποίηση µε IL-1β και TNF-α διευκολύνοντας τη διολίσθηση, την προσκόλληση, την εξαγγείωση και τη µετανάστευση των ουδετεροφίλων στους ιστούς σε θέσεις φλεγµονής. Μελετήθηκαν 35 παιδιά µε πρωτοπαθή καλοήθη ουδετεροπενία στη διάγνωση. Για τη µελέτη της δευτεροπαθούς ουδετεροπενίας χρησιµοποιήθηκαν 25 παιδιά µε οξεία λευχαιµία (23 ΟΛΛ, 2 ΟΜΛ) σε ύφεση, 16 από τα οποία είχαν εκδηλώσει ουδετεροπενία λόγω µυελοτοξικής δράσης της χηµειοθεραπείας. Την οµάδα ελέγχου αποτέλεσαν 30 παιδιά αντίστοιχης ηλικίας χωρίς κακόηθες νόσηµα ή ουδετεροπενία ή εστία λοίµωξης στα οποία το µυελόγραµµα έγινε στα πλαίσια διερεύνησης της νόσου τους. Έγιναν καλλιέργειες µονοπύρηνων κυττάρων του µυελού των οστών σε µεθυλοκυτταρίνη για την εκτίµηση του παραγόµενου αριθµού αποικιών προγονικών αιµοποιητικών κυττάρων της κοκκιώδους και της ερυθράς σειράς (CFU-GM και BFU-E αντίστοιχα). Για την εκτίµηση της επαναπολλαπλασιαστικής ικανότητας των CFU-GM που σχετίζεται µε την ικανότητα του µυελού να παράγει ώριµα ουδετερόφιλα έγιναν ανακαλλιέργειες CFU-GM την έβδοµη µέρα της καλλιέργειας και υπολογισµός του αριθµού και της κατανοµής των δευτερογενών αποικιών. Για τον ποσοτικό προσδιορισµό των επιπέδων στον ορό του G-CSF, των διαλυτών µορίων προσκόλλησης ICAM-1 και Ε-σελεκτίνης και των κυτταροκινών που επάγουν την έκφρασή τους στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων TNF-α και IL-1β χρησιµοποιήθηκε η ανοσοενζυµική τεχνική ELISA. Τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι στη χρόνια καλοήθη ουδετεροπενία είναι φυσιολογικός ο αριθµός (p= 0.29) και η επαναπολλαπλασιαστική ικανότητα των CFU- GM στο σύνολο των περιπτώσεων (p= 0.12). Η τελευταία αυξάνεται στατιστικώς σηµαντικά στις περιπτώσεις σοβαρής ουδετεροπενίας µε ΑΑΠ<500 (p= 0.03). Στο σύνολο των περιπτώσεων δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση της επαναπολλαπλασιαστικής ικανότητας των CFU-GM µε τον απόλυτο αριθµό πολυµορφοπυρήνων (r= -0.45, p= 0.26), µε τα επίπεδα του G-CSF στον ορό (r= 0.24, p= 0.5) ή µε την ηλικία διάγνωσης της νόσου (r= -0.2, p= 0.5). Στις δευτεροπαθείς ουδετεροπενίες µετά από χηµειοθεραπεία η επαναπολλαπλασιαστική ικανότητα των CFU-GM παραµένει φυσιολογική (p= 0.2), αλλά σχετίζεται αρνητικά µε τον αριθµό των κυκλοφορούντων ουδετεροφίλων (r = - 0.64, p= 0.02). Τα επίπεδα του ICAM-1 και της Ε-σελεκτίνης σχετίζονται θετικά µεταξύ τους (r= 0.55, p= 0.015) και ισχυρώς αρνητικά µε τον απόλυτο αριθµό πολυµορφοπυρήνων (r= -0.64, p= 0.003, r= -0.5, p= 0.04 για το ICAM-1 και την Ε-σελεκτίνη αντίστοιχα). Στην οµάδα της οξείας λευχαιµίας σε ύφεση η εκδήλωση ουδετεροπενίας δεν επηρέασε τις τιµές των επιπέδων των εν λόγω µορίων στον ορό των ασθενών (p= 0.14, p= 0.3 αντίστοιχα για την Ε-σελεκτίνη και το ICAM-1). Τα επίπεδα των δύο µορίων προσκόλλησης στην οµάδα της δευτεροπαθούς ουδετεροπενίας είναι σηµαντικά χαµηλότερα σε σύγκριση µε τα επίπεδα στον ορό των ασθενών µε χρόνια καλοήθη ουδετεροπενία (p<0.001 και για τα δύο µόρια) και δε σχετίζονται µε τον απόλυτο αριθµό πολυµορφοπυρήνων. Τα επίπεδα του TNF-α και της IL-1β στον ορό των ασθενών µε χρόνια καλοήθη ουδετεροπενία είναι αυξηµένα συγκριτικά µε τα επίπεδα των φυσιολογικών (p= 0.01, p= 0.04 αντίστοιχα) και των δευτεροπαθών ουδετεροπενιών (p<0.001, p= 0.5 αντίστοιχα) και σχετίζονται ισχυρώς αρνητικά µε τον αριθµό των κυκλοφορούντων ουδετεροφίλων (r= -0.58, p= 0.01 για τον TNF-α και r= -0.62, p= 0.04 για την IL-1β). Τα επίπεδα του TNF-α σχετίζονται θετικά µε τα επίπεδα του ICAM-1 και του G-CSF στον ορό (r= 0.67, p<0.01 και r= 0.65, p= 0.01 αντίστοιχα). Τα επίπεδα της IL-1β σχετίζονται θετικά µε τα επίπεδα της Ε-σελεκτίνης και του G-CSF στον ορό (r= 0.67, p= 0.04 και r= 0.67, p= 0.04 αντίστοιχα). Τα επίπεδα του G-CSF στον ορό των παιδιών µε χρόνια καλοήθη ουδετεροπενία στη διάγνωση παρουσίασαν µεγάλη διακύµανση τιµών και η πλειοψηφία αυτών κυµαίνονταν µέσα στο εύρος του φυσιολογικού. Η µέση τιµή της συγκέντρωσης G-CSF στον ορό δε διέφερε στατιστικώς σηµαντικά από τα φυσιολογικά επίπεδα (p=0.05). Τα επίπεδα του G-CSF ήταν αυξηµένα στην οµάδα της σοβαρής ουδετεροπενίας (p=0.02) αλλά στο σύνολο των περιστατικών δε βρέθηκε ισχυρή συσχέτιση των επιπέδων G-CSF µε τον αριθµό των λευκοκυττάρων (r=- 0.27, p= 0.3) ή µε τον απόλυτο αριθµό πολυµορφοπυρήνων (r= -0.2, p= 0.4). Τα επίπεδα του G-CSF σχετίζονται θετικά µε τα επίπεδα του διαλυτού ICAM-1 στον ορό (r= 0.53, p= 0.01) και µε τον αριθµό των µονοκυττάρων στο περιφερικό αίµα (r= 0.56, p= 0.03). Η µέση τιµή της συγκέντρωσης του ενδογενούς G-CSF στην ύφεση της οξείας λευχαιµίας ανεξαρτήτως ουδετεροπενίας ήταν χαµηλή και δεν διέφερε από την αντίστοιχη τιµή των φυσιολογικών (p= 0.26). Συµπερασµατικά, στη χρόνια καλοήθη ουδετεροπενία των παιδιών η διαταραχή αφορά τα ώριµα πολυµορφοπύρηνα και δεν επηρεάζει ποσοτικά τα προγονικά κύτταρα της κοκκιώδους σειράς τα οποία παρουσιάζουν αυξηµένη επαναπολλαπλασιαστική ικανότητα στις περιπτώσεις σοβαρής ουδετεροπενίας. Ο βαθµός της ουδετεροπενίας σχετίζεται θετικά µε τα επίπεδα της Ε- σελεκτίνης και του ICAM-1 στον ορό των ασθενών. Τα επίπεδα του TNF-α και της IL-1β που επάγουν την ενεργοποίηση του ενδοθηλίου και την έκφραση των δύο µορίων προσκόλλησης στην επιφάνειά του και την παραγωγή G-CSF είναι αυξηµένα στον ορό των ασθενών συγκρινόµενα µε τα φυσιολογικά και σχετίζονται θετικά µε το βαθµό της ουδετεροπενίας. Τα επίπεδα του G-CSF παρουσιάζουν µεγάλο εύρος κατανοµής αλλά στην πλειοψηφία των περιπτώσεων κυµαίνονται εντός των φυσιολογικών ορίων και δε ρυθµίζονται ανάλογα µε τον αριθµό των κυκλοφορούντων ουδετεροφίλων. Η συγκέντρωσή του G-CSF στον ορό σχετίζεται µε την ενεργοποίηση του ενδοθηλίου. Οι ενδείξεις συµµετοχής του ενεργοποιηµένου ενδοθηλίου στην εκδήλωση σοβαρής καλοήθους ουδετεροπενίας θέτουν την υποψία συνυπάρχουσας, λανθάνουσας υποκλινικής φλεγµονής

Biological Features of Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia

Objective: Mesenchymal stromal cells (MSCs) have a supportive role in hematopoiesis and as components of the bone marrow (BM) microenvironment may present alterations during acute lymphoblastic leukemia (ALL) and be affected by chemotherapeutic agents. We examined the biological and functional characteristics of MSCs in ALL diagnosis and treatment and their effect on MSC qualitative properties. Materials and Methods: Immunophenotypic characterization, evaluation of clonogenicity, and proliferative capacity were measured. Apoptotic features, cell-cycle analysis, and stromal cell-derived factor 1α and angiopoietin-1 levels in MSC supernatant at diagnosis and in different phases of treatment were assessed. Chemotherapy was administered according to the Berlin-Frankfurt-Munster-2000 protocol. BM samples from children with solid tumors without BM involvement were used as the control group. Results: The morphology, the immunophenotypic profile, and the apoptotic characteristics of the MSCs were not affected by leukemia. The secretion of factors involved in the trafficking of hematopoietic cells in the BM seems to be upregulated at diagnosis in comparison to the treatment phases. MSCs are influenced by the disease in terms of their functional characteristics such as clonogenicity and proliferation rate. These effects cease as soon as treatment is initiated. Chemotherapy does not seem to exert any effect on any of the MSC features examined. Conclusion: MSCs from children with ALL are affected by their interaction with the leukemic environment, but this phenomenon ceases upon treatment initiation, while no effect is observed by chemotherapy itself