Ex vivo multiscale quantitation of skin biomechanics in wild-type and genetically-modified mice using multiphoton microscopy

International audienceSoft connective tissues such as skin, tendon or cornea are made of about 90% of extracellular matrix proteins, fibrillar collagens being the major components. Decreased or aberrant collagen synthesis generally results in defective tissue mechanical properties as the classic form of Elhers-Danlos syndrome (cEDS). This connective tissue disorder is caused by mutations in collagen V genes and is mainly characterized by skin hyperextensibility. To investigate the relationship between the microstructure of normal and diseased skins and their macroscopic mechanical properties, we imaged and quantified the microstructure of dermis of ex vivo murine skin biopsies during uniaxial mechanical assay using multiphoton microscopy. We used two genetically-modified mouse lines for collagen V: a mouse model for cEDS harboring a Col5a2 deletion (a.k.a. pN allele) and the transgenic K14-COL5A1 mice which overexpress the human COL5A1 gene in skin. We showed that in normal skin, the collagen fibers continuously align with stretch, generating the observed increase in mechanical stress. Moreover, dermis from both transgenic lines exhibited altered collagen reorganization upon traction, which could be linked to microstructural modifications. These findings show that our multiscale approach provides new crucial information on the biomechanics of dermis that can be extended to all collagen-rich soft tissues

Analyse multi-échelles des propriétés biomécaniques de la peau de souris saine et malade

La peau est un tissu complexe composé de 3 couches : l'épiderme, le derme et l'hypoderme. Le derme est responsable de la majeure partie des propriétés mécaniques de la peau. Une modification de la composition du derme entraîne ainsi des modifications drastiques du comportement mécanique de la peau, comme dans la maladie d'Ehlers-Danlos, qui se caractérise par une hyper?élasticité des tissus. Au niveau microstructural, le derme est composé essentiellement de matrice extracellulaire, formée pour la majeure partie d'un réseau désordonné de fibres de collagène. Pour élucider le lien exact entre organisation microstructurale et propriétés mécaniques de la peau, nous réalisons des essais de traction uniaxiaux in situ sous un microscope multiphoton avec détection du signal de génération de seconde harmonique. Ceci nous permet de suivre la réponse de la microstructure du tissu au cours de l'essai mécanique. Des paramètres quantitatifs ont été développés pour caractériser à la fois la réponse mécanique macroscopique du tissu et le réarrangement du réseau de fibres de collagène sous chargement. Nous pouvons ainsi comparer le comportement multi-échelles de peau de souris saine et de peau de souris atteinte d'une mutation affectant la microstructure du derme

The Collagen V Homotrimer [α1(V)]3 Production Is Unexpectedly Favored over the Heterotrimer [α1(V)]2α2(V) in Recombinant Expression Systems

Collagen V, a fibrillar collagen with important functions in tissues, assembles into distinct chain associations. The most abundant and ubiquitous molecular form is the heterotrimer [α1(V)]2α2(V). In the attempt to produce high levels of recombinant collagen V heterotrimer for biomedical device uses, and to identify key factors that drive heterotrimeric chain association, several cell expression systems (yeast, insect, and mammalian cells) have been assayed by cotransfecting the human proα1(V) and proα2(V) chain cDNAs. Suprisingly, in all recombinant expression systems, the formation of [α1(V)]3 homotrimers was considerably favored over the heterotrimer. In addition, pepsin-sensitive proα2(V) chains were found in HEK-293 cell media indicating that these cells lack quality control proteins preventing collagen monomer secretion. Additional transfection with Hsp47 cDNA, encoding the collagen-specific chaperone Hsp47, did not increase heterotrimer production. Double immunofluorescence with antibodies against collagen V α-chains showed that, contrary to fibroblasts, collagen V α-chains did not colocalized intracellularly in transfected cells. Monensin treatment had no effect on the heterotrimer production. The heterotrimer production seems to require specific machinery proteins, which are not endogenously expressed in the expression systems. The different constructs and transfected cells we have generated represent useful tools to further investigate the mechanisms of collagen trimer assembly

Etude de la réorganisation macroscopique de la peau de souris lors d'une sollicitation bi-axiale

La peau est composée en majorité de collagène et présente une microstructure très hiérarchisée qui influe sur son comportement mécanique aux différentes échelles. Pour caractériser l'influence de la microstructure sur les propriétés mécaniques, un test de traction bi-axiale couplé à une mesure macroscopique (corrélation d'images numériques) et microscopique (génération de second harmonique) a été développé . A terme, ce travail permettra de corréler les propriétés macroscopiques à la microstructures. Cette étude présente les résultats de la mesure effectuée par corrélation d'images

Les collagènes du derme : au-delà de leurs propriétés structurales

La matrice extracellulaire est un réseau complexe de macromolécules comme les collagènes, les protéoglycannes et l'élastine qui s'imbriquent fortement les unes aux autres et qui, par l'intermédiaire d'interactions avec les cellules environnantes, vont permettre le maintien de la cohésion tissulaire. C'est grâce à ces nombreuses connexions que se mettent en place la plupart des évènements importants pour les grands programmes cellulaires, à savoir la migration, la prolifération, la différenciation et l'apoptose. La peau, et plus particulièrement le derme, est un exemple parfait de cette grande variété de molécules dont l'organisation et la composition doivent être parfaitement maintenues afin d'assurer les propriétés biomécaniques et fonctionnelles de ce tissu. Les collagènes sont les composants les plus abondants des matrices extracellulaires et représentent une famille de protéines de 27 membres différents. Mais ce sont surtout les collagènes fibrillaires I, III et V, les collagènes FACITs XII, XIV et XVI ainsi que le collagène de type VI qui sont les plus représentés dans le derme. Ces molécules sont à présent très bien caractérisées du point de vue de leur structure, mais leur fonction demeure toujours un peu floue. De nombreux gènes ont déjà été identifiés comme étant responsables de pathologies du tissu conjonctif et plus particulièrement de la peau. Les gènes codant le collagène V sont, par exemple, la cible de nombreuses mutations conduisant au syndrome d'Ehlers-Danlos classique qui est une maladie qui atteint principalement la peau et la structure du derme. Cependant, il semble clair qu'il est très difficile d'établir un lien réel entre génotype et phénotype pas plus qu'un lien entre la localisation et la fonction, pour ces molécules. Ce sont sans doute des études in vivo, dont de nombreuses sont d'ailleurs en cours de réalisation, qui devraient apporter des réponses plus claires à toutes ces interrogations

Development of a Functional Skin Matrix Requires Deposition of Collagen V Heterotrimers

Collagen V is a minor component of the heterotypic I/III/V collagen fibrils and the defective product in most cases of classical Ehlers Danlos syndrome (EDS). The present study was undertaken to elucidate the impact of collagen V mutations on skin development, the most severely affected EDS tissues, using mice harboring a targeted deletion of the α2(V) collagen gene (Col5a2). Contrary to the original report, our studies indicate that the Col5a2 deletion (a.k.a. the pN allele) represents a functionally null mutation that affects matrix assembly through a complex sequence of events. First the mutation impairs assembly and/or secretion of the α1(V)(2)α2(V) heterotrimer with the result that the α1(V) homotrimer is the predominant species deposited into the matrix. Second, the α1(V) homotrimer is excluded from incorporation into the heterotypic collagen fibrils and this in turn severely impairs matrix organization. Third, the mutant matrix stimulates a compensatory loop by the α1(V) collagen gene that leads to additional deposition of α1(V) homotrimers. These data therefore underscore the importance of the collagen V heterotrimer in dermal fibrillogenesis. Furthermore, reduced thickness of the basement membranes underlying the epidermis and increased apoptosis of the stromal fibroblasts in pN/pN skin strongly indicate additional roles of collagen V in the development of a functional skin matrix

Corrélation des propriétés mécaniques et micro-structurelles de la peau de souris à partir d'une sollicitation bi-axiale

International audienceLe derme, composant principal de la peau, est composée en majorité de collagène et présente une micro-structure très hiérarchisée qui influe sur son comportement mécanique aux différentes échelles. La prédiction de son comportement nécessite de caractériser l’influence de la micro-structure sur les propriétés mécaniques. Aussi, un test de traction bi-axiale couplé indépendamment à une mesure macroscopique et à une mesure microscopique a été développé. Ce travail a finalement permis d’identifier les paramètres d’une loi hyper-élastique anisotrope et de tester l’hypothèse de transformation affine sous-jacent au comportement adopté