Mutants of common bean alpha-amylase inhibitor-2 as an approach to investigate binding specificity to alpha-amylases

Apesar de possuir uma família de proteínas de defesa, o feijão-comum (Phaseolus vulgaris L.) pode ser atacado por insetos bruquídeos causando sérios danos aos grãos armazenados. O P. vulgaris possui duas formas ativas de inibidores de a-amilases, denominadas a-AI1 e a-AI2, que apresentam diferentes especificidades em relação às a-amilases. A a-amilase de Zabrotes subfasciatus é inibida por a-AI2 mas não por a-AI1. Em contraste, a a-amilase pancreática de porco é inibida por a-AI1 mas não é por a-AI2. O objetivo deste trabalho foi entender as bases moleculares da especificidade desses inibidores em relação às a-amilases. Para tanto, foram construídos mutantes do a-AI2, os quais foram expressados em plantas de fumo. Todos os inibidores mutantes deixaram de inibir a a-amilase de inseto sem, contudo, passar a exibir atividade contra a a-amilase de mamífero. Os modelos estruturais explicam por que a substituição de His33 do a-AI2 pela seqüência correspondente do a-AI1 (Ser-Tyr-Asn) aboliu a inibição da a-amilase de Z. subfasciatus. Dos estudos de modelagem molecular pode-se concluir que o tamanho e a complexidade da interface a-amilase-inibidor explicam por que a mutação da alça N-terminal e a quebra da atividade inibitória para a-amilase de Z. subfasciatus não levam ao ganho de atividade inibitória do mutante em relação à a-amilase de porco.Despite the presence of a family of defense proteins, Phaseolus vulgaris can be attacked by bruchid insects resulting in serious damage to stored grains. The two distinct active forms of α-amylase inhibitors, α-AI1 and α-AI2, in P. vulgaris show different specificity toward α-amylases. Zabrotes subfasciatus α-amylase is inhibited by α-AI2 but not by α-AI1. In contrast, porcine α-amylase is inhibited by α-AI1 but not by α-AI2. The objective of this work was to understand the molecular basis of the specificity of two inhibitors in P. vulgaris (α-AI1 and α-AI2) in relation to α-amylases. Mutants of α-AI2 were made and expressed in tobacco plants. The exhibited activity toward the mammalian α-amylase. The replacement of His33 of α-AI2 with the α-AI1-like sequence Ser-Tyr-Asn abolished inhibition of Z. subfasciatus α-amylase. From structural modeling, the conclusion is that the size and complexity of the amylase-inhibitor interface explain why mutation of the N-terminal loop and resultant abolition of Z. subfasciatus α-amylase inhibition are not accompanied by gain of inhibitory activity against porcine α-amylase