MOLECULAR DIAGNOSTIC OF HAEMONCHUS CONTORTUS RESISTANCE TO THE BENZIMIDAZOLE GROUP IN SHEEP AND GOATS IN THE STATE OF PERNAMBUCO, BRAZIL

Ovinos e caprinos sofrem grande prejuízo clínico provocados pela alta prevalência de parasitos gastrintestinais, principalmente pelo nematoda Haemonchus contortus. Este parasito causa alta morbidade e mortalidade, entretanto, o uso indiscriminado de fármacos para seu controle tem provocado a seleção de populações resistentes. O diagnóstico molecular da resistência ao grupo dos benzimidazóis (BZs) é muito importante para indicar estratégias substitutivas de manejo e controle. O objetivodeste estudo foi determinar pela primeira vez, a presença da mutação na posição F200Y do isotipo 1 do gene da beta-tubulina, em sete populações de H. contortus de ovinos e caprinos no estado de Pernambuco, Brasil. Amostras de DNA foram extraídas de 20 machos adultos, obtidos de animais naturalmente parasitados, em propriedades de Recife, Sairé, Camocim de São Félix, Gameleira, Moreno, Bonito e Serra Talhada. Os iniciadores forward: 5’ AAT GCT ACC CTT TCC GTC CAT C 3’ e reverse: 5’ CAA AAC CGGCA TGA AGA AG 3’ foram utilizados para a pesquisa da principal mutação no gene da beta-tubulina, para determinar a resistência ao grupo dos BZs. Os iniciadores NC1/ITS-2, forward: 5’ ACG TCT GGT TCA GGG TTG TT 3’ e reverse: 5’ TTA GTT TCT TTT CCT CCG CT 3’ foram usados para a confirmação de H. contortus. Um questionário foi utilizado para obtenção de informações sobre práticas de manejo, incluindo a frequência de uso dos BZs. As sequencias NC1/ITS-2 confirmaram a presença de H. contortus em todas as populações. A mutação F200Y responsável pela resistência (TTC/TAC) de H. contortus ao BZ, foi encontrada na amostra proveniente de Sairé, sendo que a proporção do códon TTC variou entre 55.6 a 85.7%. Relativo ao questionário, todos os produtores revelaram ausência de quarentena para os animais recém-adquiridos; alta frequência de aplicação de anti-helmínticos (60 em 60 dias); tratamento de todo o rebanho; estimativa visual do peso dos animais para cálculo da dosagem do medicamento; e alta rotação de antihelmínticos. Foi relatado ainda, a carência de assistência técnica especializada, sem exame rotineiro de fezes nos animais. Muito embora, todos estes fatores possam ser fundamentais para aumentar a pressão de seleção parasitária, não foi possível determinar qual deles poderia representar um ou mais fatores de risco, devido ao grande número de variáveis e o baixo número de respondentes. Esta é sem dúvida uma grande dificuldade para correlacionar os dados fenotípicos de eficácia (ex. TRCOF), com os marcadores genotípicos (ex. PCR) de resistência em helmintos. Foram incluídos os fatores de risco relatados por criadores de Pernambuco e sua influência nos processos de seleção anti-helmíntica, assim como estratégias para mitigar esta situação. Os dados apresentados são o primeiro registro molecular da mutação F200Y que confere resistência ao grupo dos BZs em pequenos ruminantes no estado de Pernambuco, Brasil. Sheep and goats suffer heavy losses due to the high prevalence of gastrointestinal nematodes, mainly from the nematode Haemonchus contortus. The parasite causes high morbidity and mortality, even though, the indiscriminate use of chemicals to control H. contortus has favored the selection of multidrug resistance parasites. Molecular diagnosis of resistance to the benzimidazole (BZs) group is important to indicate substitute strategies of control. The aim of this study was to determine the presence of the mutation at position F200Y of the beta-tubulin gene in seven populations of H. contortus from sheep and goats’ farms from the state of Pernambuco, Brazil. Twenty adult H. contortus male worms were recovered for DNAextraction from naturally infected animals, from farms from Recife, Sairé, Camocim deSão Félix, Gameleira, Moreno, Bonito, and Serra Talhada. The primers forward: 5` AAT GCT TCC ACC CTT GTC CAT C 3’, and reverse: 5’ CAA CAA CGG GCA TGA AGA AG 3’ were used to search for the main codon (F200Y) of the beta-tubulin gene to determine BZ resistance. The NC1/ITS-2 forward: 5’ ACG TCT GGT TCA GGG GTT TT 3’ and reverse: 5’ TTA TCT GTT TTT CCT GCC CT 3’ primers were used for confirming H. contortus species. A questionnaire was applied to obtain information on management practices, including the frequency of BZs use. The sequences from the NC1/ITS-2 confirmed the presence of H. contortus from all samples. The F200Y mutation responsible for BZ resistance (TTC/TAC) in H. contortus was found only in the samples from Sairé, as the TTC codon varied from 55.6 to 85.7%. In relation to the questionnaire, producers revealed the absence of quarantine for newly arrived animals; high drug treatment frequency (60-days interval); treatment of the whole flock; the visual estimation of the weight of the animals for dose determination; and high drug rotation. It was also mentioned the lack of veterinary assistance with no use of fecal exams. Even though, all these factors may be essential to increase parasite selection pressure, it was not possible to determine which of those showed a higher risk due to the high number of variables and the small number of participants. This is without any doubt one of the great difficulties to correlate phenotypic drug efficacy data (ex. FECRT) and genotypic-related (ex. PCR) resistance markers in helminths. We have included some risk factors reported by the farmers from Pernambuco and their influences in the process of drug selection, as well as a few strategies to mitigate this situation. The present report constitutes the first record of a molecular diagnosis of the mutation F200Y that confers resistance to the BZ group in ruminants in the state of Pernambuco, Brazil